萬(wàn)婷婷，羅愛(ài)平,*，何光中，李 麗，陳 明

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550000)

兩種來(lái)源酶多種方式水解牛骨蛋白

萬(wàn)婷婷1，羅愛(ài)平1,*，何光中2，李 麗1，陳 明1

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550000)

選用兩種不同來(lái)源的枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶，以水解度為特征性指標(biāo)，采用5種不同水解方式水解牛骨蛋白。結(jié)果表明：枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同步水解，效果優(yōu)于木瓜蛋白酶與枯草桿菌中性蛋白酶分步水解兩種方式，最佳酶體系反應(yīng)條件為pH7.05、溫度51℃、加酶總量7000U/g(枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比1∶1)、150r/min 振蕩水解6h，水解度可達(dá)27.54%。

牛骨蛋白；水解；木瓜蛋白酶；枯草桿菌中性蛋白酶；水解度

我國(guó)蛋白質(zhì)資源緊缺，大力開(kāi)發(fā)和合理利用蛋白質(zhì)資源顯得非常必要。目前，蛋白質(zhì)水解主要有酸法、堿法和酶法[1]。酸、堿法由于條件苛刻而趨于淘汰，酶法具有定向、易控、溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此，現(xiàn)在較多采用酶法。

蛋白酶按其來(lái)源分為植物蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶及微生物蛋白酶3類(lèi)[2]。綜合考慮酶的來(lái)源、價(jià)格、水解效果及反應(yīng)條件[3]，試驗(yàn)選用木瓜蛋白酶與枯草桿菌中性蛋白酶。木瓜蛋白酶可作用于蛋白質(zhì)中的甘氨酸及賴(lài)氨酸等殘基參與形成的肽鍵，枯草桿菌中性蛋白酶專(zhuān)一性廣泛，肽鍵的一側(cè)含有疏水性氨基酸的肽鍵均可被其水解[4]。

單一酶的作用范圍小，水解度不高，所得的酶解產(chǎn)物多為多肽，且分子質(zhì)量較大[5]。利用不同性質(zhì)不同水解位點(diǎn)的兩種或兩種以上酶水解，根據(jù)水解底物的方式不同實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的深度水解。枯草桿菌中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的反應(yīng)條件相當(dāng)，兩者的最適pH值接近中性，且兩種酶的專(zhuān)一性底物又具有一定的互補(bǔ)性。

本研究以牛骨粉為水解反應(yīng)底物，選擇植物蛋白酶與微生物蛋白酶兩種不同來(lái)源的酶，采用不同水解方式水解牛骨蛋白，以期達(dá)到較高的水解度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨粉(粒度200目)為貴州大學(xué)動(dòng)物性食品綜合實(shí)驗(yàn)室自制[6]。

枯草桿菌中性蛋白酶(10萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(10萬(wàn)U/g) 南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LD4-2型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；HI98128型pH計(jì) 北京惠通卓越科技發(fā)展有限公司；FW-80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 東莞市創(chuàng)瑞工業(yè)試驗(yàn)設(shè)備有限公司；THZ-98A恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；YX-28OB型蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨蛋白水解工藝

工藝流程：牛骨粉→加水→調(diào)節(jié)pH值→水解→滅酶→冷卻→離心→取上清液→測(cè)定水解度及氮收率。

操作要點(diǎn)：牛骨粉加適量蒸餾水充分混勻后，按照設(shè)計(jì)方案置恒溫振蕩培養(yǎng)箱150r/min 振蕩水解，水解完畢后于85～90℃滅酶10min，冷卻至常溫，4000r/min離心10min，取上清液測(cè)定水解度及氮收率。

1.3.2 牛骨蛋白水解體系條件優(yōu)化

1.3.2.1 水解方式確定

固定牛骨粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%[7]、pH7、水解溫度50℃、加酶總量4000U/g、枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶復(fù)合水解時(shí)的酶用量比1∶1為酶反應(yīng)體系，以水解度和氮收率為指標(biāo)，研究不同水解方式對(duì)目標(biāo)值的影響。分別選取5種水解方式：Ⅰ：木瓜蛋白酶單酶振蕩水解6h；Ⅱ：枯草桿菌中性蛋白酶單酶振蕩水解6h；Ⅲ：枯草桿菌中性蛋白酶先振蕩水解3h滅酶后，加入木瓜蛋白酶振蕩水解3h；Ⅳ：木瓜蛋白酶先振蕩水解3h滅酶后，加入枯草桿菌中性蛋白酶振蕩水解3h；Ⅴ：枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同時(shí)振蕩水解6h。確定最佳水解方式。

1.3.2.2 水解時(shí)間的確定

在酶反應(yīng)體系及評(píng)價(jià)指標(biāo)不變的條件下，設(shè)定水解時(shí)間分別為4、5、6、7、8h，確定最適宜的水解時(shí)間。

1.3.2.3 枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比的確定

設(shè)定枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3(m/m)，在其他酶反應(yīng)體系及評(píng)價(jià)指標(biāo)不變的條件下，振蕩水解6h。確定最佳酶用量比。

1.3.2.4 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[8-10]，以水解度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)，對(duì)牛骨蛋白水解體系條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

水分測(cè)定：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定：直接干燥法》；灰分測(cè)定：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定：灼燒稱(chēng)重法》；脂肪測(cè)定：參照GB/T 22223—2008《食品中脂肪的測(cè)定：索氏抽提法》；蛋白質(zhì)、總氮量測(cè)定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定：微量凱氏定氮法》；鈣測(cè)定：參照GB/T9695.13—2009《食品中鈣的測(cè)定：高錳酸鉀滴定法》；游離氨基氮測(cè)定：參照GB/T5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法：甲醛電位滴定法》；pH值測(cè)定：采用pH測(cè)定儀測(cè)定；水解度測(cè)定：參照文獻(xiàn)[11]方法；氮收率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[12]方法。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，采用Design Expert 7.1.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，并對(duì)數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料基本成分

表1 牛骨及牛骨粉的基本營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Basic nutritional components in bovine bone and bone powder

將新鮮牛骨制備成牛骨粉，蛋白質(zhì)暴露面積增加，有利于其水解。由表1可知，原料牛骨經(jīng)處理加工為牛骨粉后，蛋白質(zhì)占總量的23.30%，表明試驗(yàn)用的底物蛋白質(zhì)含量高。

2.2 不同水解方式水解牛骨蛋白的結(jié)果

表2 不同水解方式水解牛骨蛋白結(jié)果Table 2 Effect of dual-enzyme hydrolysis method on the degree of hydrolysis

衡量蛋白質(zhì)的水解效果常用兩個(gè)指標(biāo)，即氮收率與水解度。氮收率一般用水解后得到的可溶性氮占總氮的比例表示，水解度是基于蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵數(shù)目來(lái)衡量水解效果[13]。由表2可知，Ⅴ組的水解度與氮收率分別為18.69%、65.62%，比Ⅲ組分別提高5.06%、5.75%，差異顯著(P＜0.05)。比Ⅳ組分別提高12.73%、9.11%，差異顯著(P＜0.05)。同步水解期間不需加熱滅酶，操作簡(jiǎn)單，在實(shí)際生產(chǎn)中可操作性強(qiáng)。從實(shí)際生產(chǎn)和發(fā)揮兩種酶最大活力考慮，確定Ⅴ組即枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同步水解的方式水解牛骨蛋白。

Ⅴ組的水解度與氮收率比Ⅰ組分別提高45.79%、37.34%，差異顯著(P＜0.05)，比Ⅱ組分別提高18.07%、12.88%，差異顯著(P＜0.05)，故利用兩種酶不同水解位點(diǎn)的性質(zhì)可提高牛骨蛋白的水解度。

2.3 水解時(shí)間對(duì)牛骨蛋白水解效果的影響由圖1可知，水解度與氮收率在4～6h呈上升趨勢(shì)，分別達(dá)18.69%、73.06%，在6～8h其值趨于平緩。反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，增加經(jīng)濟(jì)成本，因美拉德反應(yīng)會(huì)影響酶解物的外觀顏色，還會(huì)產(chǎn)生一些短肽類(lèi)的苦味物質(zhì)[14-17]。綜合考慮酶解時(shí)間以6h為宜。

2.4 枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比對(duì)牛骨蛋白水解效果的影響

圖2 枯草桿菌中性蛋白與木瓜蛋白酶用量比對(duì)水解效果的影響Fig.2 Effect of papain-neutral protease ratio on hydrolysis efficiency

由圖2可知，隨著枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比的變化，氮收率呈先上升后下降的趨勢(shì)，而水解度變化平緩，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究?？莶輻U菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比為1∶1時(shí)，氮收率與水解度均達(dá)最大值，分別為73.06%、18.69%。故確定枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比為1∶1。

2.5 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化兩種酶同步水解牛骨蛋白工藝條件

氮收率一般用水解后得到的可溶性氮占總氮的比例表示，由于蛋白質(zhì)水解到一定程度后肽分子在水中已經(jīng)得到很好的溶解，更大程度的水解不會(huì)從氮收率上進(jìn)一步表現(xiàn)，所以對(duì)于水解程度較大的產(chǎn)物不能反映實(shí)際水解情況。水解度是從蛋白質(zhì)水解時(shí)斷裂的肽鍵數(shù)上來(lái)定義蛋白質(zhì)水解程度，所以水解度可以最準(zhǔn)確地反映出蛋白質(zhì)水解程度的大小[13]，故以水解度為響應(yīng)值，優(yōu)化兩種酶同步水解牛骨蛋白的體系條件，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 兩種酶同步水解牛骨蛋白二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing dual-enzyme hydrolysis process

表4 兩種酶同步水解牛骨蛋白二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Design and results of orthogonal tests for optimizing dual-enzyme hydrolysis process

采用Design Expert 7.1.6軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y＝24.99＋4.22A＋2.34B＋1.35C－0.43AB－ 0.45AC－0.31BC－1.63A2－8.55B2－2.60C2。結(jié)果方程分析見(jiàn)表5。

表5 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)回歸分析表Table 5 Variance analysis for the regression model

由表5可知，模型極顯著(P＝0.0002)，失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)之間具有非常好的擬合性。方程中A、B的P值均小于0.05，表明酶用量、pH值對(duì)水解度影響顯著，溫度對(duì)水解度影響不顯著，其中加酶總量影響最大，pH值影響次之，溫度對(duì)水解度影響最小。交互項(xiàng)對(duì)水解度影響均不顯著，pH值及溫度的二次項(xiàng)對(duì)水解度影響顯著。

圖3中每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)另外兩個(gè)變量保持在最佳水平。

圖3 各兩因素交互作用的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effects of crossinteractions among factors on hydrolysis efficiency

由圖3a可知，水解度隨pH值的升高和加酶總量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。因?yàn)槊笇?duì)底物pH值比較敏感，pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低酶解效果。由圖3b可知，水解度隨溫度的升高和加酶總量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。加酶總量過(guò)高時(shí)，由于酶本身的相互水解作用加強(qiáng)，會(huì)阻礙酶對(duì)底物的酶解[18]。由圖3c可知，水解度隨pH值和溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。溫度是影響酶活力的重要因素之一，溫度過(guò)高或過(guò)低均影響酶活力。

極值條件應(yīng)在等高線(xiàn)的橢圓圓心處[19]。為得到水解度最佳條件，令回歸方程一階偏倒數(shù)等于零，整理得到方程組，解方程組即為3因素的最佳水平代碼值，即加酶總量7000U/g、pH7.05、溫度50.83℃。計(jì)算結(jié)果表明加酶量、pH值及溫度均在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)。考慮生產(chǎn)實(shí)際及應(yīng)用方便，校正溫度51℃。按最佳條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，水解度的平均值為27.54%，比理論值27.76%低0.79%。比吳敏等[14]報(bào)道水解度18.34%提高50.16%，可能與選擇酶的種類(lèi)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有關(guān)。

3 結(jié) 論

3.1 采用枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同步水解，其水解效果優(yōu)于先木瓜蛋白酶后枯草桿菌中性蛋白酶及先枯草桿菌中性蛋白酶后木瓜蛋白酶。蛋白質(zhì)水解度分別為18.69%、17.79%、16.31%，差異顯著(P＜0.05)。

3.2 兩種酶同步水解的水解度與氮收率分別為18.69%、65.62%，比枯草桿菌中性蛋白酶單酶水解分別提高18.07%、12.88%，差異顯著(P＜0.05)，比木瓜蛋白酶單酶水解分別提高45.79%、37.34%，差異顯著(P＜0.05)。故利用兩種酶不同水解位點(diǎn)的性質(zhì)可提高牛骨蛋白的水解度。

3.3 采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水解牛骨蛋白最佳酶解體系反應(yīng)條件為pH7.05、溫度51℃、酶總量7000U/g(枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶酶用量比1∶1)，在150r/min振蕩水解6h，水解度可達(dá)27.54%。

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Dual-enzyme Hydrolysis of Bovine Bone Protein Using Different Methods

WAN Ting-ting1，LUO Ai-ping1,*，HE Guang-zhong2，LI Li1，CHEN Ming1
(1. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China；
2. Animal Husbandry and Veterinary Science Institute of Guizhou Province, Guiyang 550000, China)

Two proteases includingBacillussubtilis neutral protease and papain are used to hydrolyze bovine bone protein by five hydrolysis methods. The optimal dual-enzyme hydrolysis conditions of bone protein were explored for maximizing hydrolysis efficiency. The results indicated that synchronous hydrolysis of bone protein exhibited a higher hydrolysis efficiency when compared with the sequential hydrolysis by papain first and thenBacillusprotease orBacillusprotease first and then papain. The optimal hydrolysis conditions were total enzyme amount of 7000 U/g at papain-neutral protease ratio of 1∶1,oscillation hydrolysis time of 6 h, oscillation speed of 150 r/min, hydrolysis temperature of 51 ℃, hydrolysis pH of 7.05 and substrate concentration of 10%. Under the optimal hydrolysis conditions, the degree of hydrolysis was up to 27.54%.

bone protein；hydrolysis；Bacillusprotease；papain；degree of hydrolysis

TS251.2

A

1002-6630(2012)10-0119-05

2011-04-27

貴州省科技廳資助項(xiàng)目(黔科合NY字[2007]3021號(hào))；貴州省農(nóng)業(yè)委員會(huì)資助項(xiàng)目(GZCYTX-0301-03)；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(校研農(nóng)2011021)

萬(wàn)婷婷(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幨迟Y源利用。E-mail：wan_tingting_hi@126.com ；

*通信作者：羅愛(ài)平(1958—)，女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：luoaiping58@126.com