包 榮，李 榮，譚 津，姜子濤*

(天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134)

鈦膠柱反相高效液相色譜法測定飲料中的阿斯巴甜

包 榮，李 榮，譚 津，姜子濤*

(天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134)

建立基于鈦膠柱對無糖可樂中甜味劑阿斯巴甜的高效液相色譜快速測定方法。色譜條件：分離柱為Titania Sachtopore-RP柱(250mm×4.6m，5μm)，柱溫70℃，流動相為V[15mmol/L磷酸銨緩沖溶液，(NH4)2HPO4:NH4H2PO4＝6:4；10mmol/L氟化銨]-V(甲醇)＝70:30，流速1mL/min，檢測波長217nm。線性范圍為10～2500μg/mL，最低檢出限為0.08μg/mL，回收率為92.5%～97.4%，相對標準偏差(n＝8)小于0.72%。本法準確度和精密度均可滿足飲料中阿斯巴甜的測定要求。

阿斯巴甜；鈦膠柱；高效液相色譜法；無糖可樂

阿斯巴甜(aspartame)又名甜味素、天冬甜母、天冬甜精，學名稱為天門冬酰苯丙氨酸甲酯(分子式為C14H18N2O5，相對分子質量為294.31)，化學結構見圖1。

圖1 阿斯巴甜的化學結構Fig.1 Chemical structure of aspartame

阿斯巴甜的甜味特征幾乎與蔗糖相同，較純正，甜度是蔗糖的200倍[1]。阿斯巴甜在干燥狀態(tài)下較穩(wěn)定，在溶液中的穩(wěn)定性受pH值、溫度和放置時間的影響較大[2]。溶液pH值在3～6時，其穩(wěn)定性良好，pH＜3時易水解成天冬氨酰苯丙氨酸，當pH＞6時易環(huán)化生成苯甲基-3,6-雙氧-2-哌嗪乙酸。在室溫下，當pH值為4.3時最為穩(wěn)定，半衰期約為300d。在pH7的環(huán)境下，其半衰期則僅有數(shù)天。然而大部分飲料的pH值都介于2.36～3.98間[3]，所以添加在飲料中的阿斯巴甜均很穩(wěn)定。1967年美國將其作為甜味劑使用。目前已有包括中國和美國在內的80多個國家允許將阿斯巴甜應用于除罐頭食品外的所有食品，其用量按生產需要適量使用[4]。因阿斯巴甜甜味高和熱量低，主要添加于飲料、維他命含片或口香糖代替糖的使用。許多糖尿病患者、減肥人士都以阿斯巴甜作為糖的代用品。但阿斯巴甜受溫容易分解而失去甜味，不適用于熱加工食品。另外，由于苯酮尿癥患者無法代謝苯丙氨酸等含苯環(huán)類的氨基酸，因此需避免接觸阿斯巴甜。

目前，全球阿斯巴甜的年消費增長率已超過20%，遠遠超過其他人工合成甜味劑平均增長率5%的速度。但目前國際上對阿斯巴甜的安全性存在很大爭議，多國研究人員動物實驗證明了阿斯巴甜對人體有害，并呼吁阿斯巴甜下架。但也有人認為，阿斯巴甜能致人患腫瘤這一說法缺乏科學依據[5]。無論如何，阿斯巴甜作為一種食品添加劑，其應用范圍正逐漸擴大，為避免其對人體的潛在危害，添加量應受到嚴格監(jiān)控，為此有必要完善在食品中快速檢測阿斯巴甜含量的方法。關于阿斯巴甜含量的測定方法已有氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[5,7-12]和毛細管電泳法[12-15]方面的報道。但由于硅膠ODS柱本身固有的“第二效應”的存在，常常導致阿斯巴甜色譜峰對稱性差，影響分離效率，色譜柱壽命降低。

鈦膠基質固定相是近年發(fā)展起來的新型色譜填料，其具有傳統(tǒng)的硅膠基質固定相不可比擬的優(yōu)點，不存在硅膠固定相對堿性化合物存在“不可逆吸附”的致命缺陷。并且鈦膠具有極好的化學穩(wěn)定性，在pH1～14的范圍內都是非常穩(wěn)定的，而硅膠固定相則僅僅適用于pH3～9的范圍內。在現(xiàn)在的研究中，將應用鈦膠基質C18作為固定相，建立鈦膠柱反相高效液相色譜法測定飲料中阿斯巴甜的新方法，并應用于無糖可樂樣品中阿斯巴甜的含量測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

無糖可樂 市購；阿斯巴甜標準品(aladdin，99.0%)，配制成2.5mg/mL標準貯備液：稱取0.125g阿斯巴甜置于50mL容量瓶中，用純凈水(H3PO4調至pH4.3)溶解并定容至刻度，置于冰箱備用。甲醇(色譜純)、磷酸氫二銨(色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司；氟化銨(色譜純)、磷酸二氫銨(色譜純) 天津市光復精細化工研究所；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司。

1200系列高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；鈦膠基質C18反相色譜柱(Sachtopore-RP，5μm diameter，300A°pore size，250mm × 4.6mm i.d.) 美國 Zirchrom 公司；FA1104N電子天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 色譜條件

流動相為V[15mmol/L磷酸銨緩沖溶液，(NH4)2HPO4:NH4H2PO4＝6:4；10mmol/L氟化銨]-V(甲醇)＝70:30，等梯度洗脫流速1.0mL/min，柱溫70℃，紫外波長掃描范圍200～400nm。以保留時間和紫外吸收譜圖定性，峰面積定量。

1.3 標準曲線的繪制

取2.5mg/mL阿斯巴甜標準貯備液，分別稀釋為10、50、100、200、500、800、1000μg/mL，依次取20μL進樣，以阿斯巴甜質量濃度/(μg/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線并計算線性回歸方程。

1.4 樣品測定

取適量不同品牌的市售無糖可樂樣品，超聲脫氣后，準確量取1mL的樣品放入10mL比色管中，稀釋至刻度，經0.45μm微孔濾膜過濾后進樣20μL。根據阿斯巴甜色譜峰面積，通過標準曲線計算得到樣液中的阿斯巴甜質量濃度。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

用紫外分光光度計對稀釋后可樂樣品在200～400nm范圍內進行波長掃描，由掃描結果可知：阿斯巴甜的最大吸收波長出現(xiàn)在217nm，故后面的測定中選擇色譜UV檢測器的波長為217nm。阿斯巴甜標準品的色譜圖見圖2。

圖2 阿斯巴甜標準品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of aspartame standard

2.2 柱溫選擇

經考察，柱溫對半峰寬及保留時間影響顯著。保持流動相其他條件不變，改變柱溫，分別為25、40、50、60、70℃。結果顯示，隨柱溫增大柱效不斷提高，見圖3。為達到阿斯巴甜的最佳分離，實驗選擇柱溫70℃。之所以沒有繼續(xù)提高溫度，因有資料顯示阿斯巴甜在80℃左右會有部分分解，同時色譜流動相的產氣現(xiàn)象會較明顯。

圖3 塔板數(shù)與柱溫的關系Fig.3 Effect of column temperature on the number of plates

2.3 流動相中磷酸鹽濃度的選擇

分別選取流動相中磷酸鹽的濃度為5、10、15mmol/L和17mmol/L進行分析。結果如圖4所示，隨磷酸鹽濃度增大，峰寬及保留時間均減小，因此，選擇磷酸鹽濃度最佳條件15mmol/L。磷酸鹽濃度過小，阿斯巴甜峰展寬現(xiàn)象比較嚴重；磷酸鹽濃度過大時，阿斯巴甜保留時間短，溶劑峰及其他保留值較小的物質易產生干擾。

圖4 半峰寬(A)、保留時間(B)與磷酸鹽濃度的關系Fig.4 Effect of ammonium phosphate buffer concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.4 流動相pH值的選擇

改變流動相中緩沖液的pH值，即(NH4)2HPO4和NH4H2PO4的比例分別為3:7、1:1、6:4、7:3和8:2，之后用于阿斯巴甜的色譜分析。結果表明，(NH4)2HPO4:(NH4)H2PO4越大，即pH值越大，峰寬和保留時間越小，見圖5。選擇最佳條件(NH4)2HPO4:(NH4)H2PO4＝6:4。若此比例繼續(xù)增大，峰寬會減小，但保留時間過短不易與雜質分離。

圖5 半峰寬(A)、保留時間(B)與磷酸鹽比例的關系Fig.5 Effect of ammonium phosphate composition on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.5 流動相中氟化銨濃度的選擇

分別選取5、10、12、15mmol/L考察氟化銨濃度對分析效果的影響。結果顯示，隨氟化銨濃度增大，峰寬及保留時間增大，增大至10mmol/L后，曲線趨于平滑，影響較小，見圖6。選擇氟化銨濃度最佳條件10mmol/L，濃度較小時，保留時間較短易產生干擾。

圖6 半峰寬(A)、保留時間(B)與氟化銨濃度的關系Fig.6 Effect of ammonium fluoride concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.6 流動相中甲醇體積分數(shù)的選擇

固定以上條件，分別配制甲醇體積分數(shù)2 0%、30%、40%和50%的溶液。當甲醇體積分數(shù)為20%時，阿斯巴甜峰形較寬；40%和50%時出峰時間太短，不易與雜質分離，見圖7?？梢娫?0%時，出峰時間適中，峰形較好，且可與樣品中雜質分離，故選用甲醇體積分數(shù)為30%。

圖7 半峰寬(A)、保留時間(B)與甲醇體積分數(shù)的關系Fig.7 Effect of methanol concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.7 檢出限及線性范圍

以達到信噪比3倍的信號值為最低檢出限，計算得0.08μg/mL。同時考察此方法的線性范圍，選取10、50、100、200、500、800、1000μg/mL和2500μg/mL 八個質量濃度。結果顯示：當阿斯巴甜在10～2500μg/mL范圍內，標準曲線線性良好，線性回歸方程為Y＝177.7034＋15.6243X(R2＝ 0.9994)。

2.8 方法精密度和準確度

圖8 3種無糖可樂樣品的色譜圖Fig.8 Chromatogram of three diet coke samples

在選定的色譜條件下，分別用200μg/mL和500μg/mL標準溶液重復進樣8次，計算得準確度相對標準偏差小于0.72%。在3個可樂樣品中加入一定量的阿斯巴甜標準品，與樣品一致處理后進樣測定，樣品測定結果及方法回收率見表1，樣品色譜圖見圖8。由表1可見，本法回收率范圍為92.5%～97.4%，平均回收率為95.4%(標準溶液及樣品均平行測定3次取平均值)。

表1 樣品測定結果和加標回收率Table 1 Determination results of samples and spiked recoveries

3 結 論

鈦膠基質色譜固定相為近年來出現(xiàn)的新型色譜填料，其研究和應用有待于進一步深入，本研究結果顯示：在最低檢出限、精密度、線性范圍方面鈦膠柱已略見優(yōu)勢，有較好的應用前景。現(xiàn)階段鈦膠柱仍存在比表面積較小，柱效較低的缺陷，因此峰形略寬。在此之前雖有流動相中不添加緩沖液的報道，但在鈦膠高效液相色譜測定的實際應用中，往往存在色譜峰形較差拖尾等現(xiàn)象。本法簡單易操作、選擇性強、常見成分無干擾、精密度、重現(xiàn)性和回收率較高，適用于無糖可樂及其他食品樣品中阿斯巴甜的定量分析。從經濟角度講，流動相采用甲醇-水體系，與乙腈相比節(jié)約成本，適于推廣應用。

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Determination of Aspartame in Diet Coke Samples by RP-HPLC on Titania

BAO Rong，LI Rong，TAN Jin，JIANG Zi-tao*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

A method to determine aspartame in diet coke by high performance liquid chromatography on a titania column was described in this paper. The samples were separated on a titania Sachtopore-RP column (250 mm×4.6 mm, 5 μm at 70 ℃ using 15 mmol/L ammonium phosphate buffer ((NH4)2HPO4:NH4H2PO4=6:4) added with 10 mmol/L ammonium fluoride and methanol in the ratio of 70 to 30 as mobile phase. The flow rate was 1 mL/min and the detection wavelength was 217 nm. The linear range of the method was 10－2500 μg/mL with a Detection limit of 0.08 μg/mL. The recoveries of the method were between 92.5%and 97.4%. The relative standard deviation of the method was less than 0.72%. The method is simple, fast, accurate and precise and may be used in the determination of aspartame in drinks.

aspartame；titania；RP-HPLC；sugarless coke

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0150-05

2011-04-26

國家自然科學基金面上項目(20875069)

包榮(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品添加劑研究。E-mail：hedi572006@126.com

*通信作者：姜子濤(1956—)，男，教授，博士，主要從事食品添加劑與食品分析研究。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn