Chelex法結(jié)合環(huán)介導(dǎo)間接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)肉制品單增李斯特菌

鄭 鳴，邊傳周，劉仲敏

(1.鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校，河南 鄭州 450011；2.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008)

Chelex法結(jié)合環(huán)介導(dǎo)間接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)肉制品單增李斯特菌

鄭 鳴1，邊傳周1，劉仲敏2

(1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450011；2.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008)

目的：建立肉制品中單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)間接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。方法：采用Chelex法從肉制品中分離模板DNA，根據(jù)單增李斯特菌hlyA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)兩條探針，將探針標(biāo)記于報(bào)告基因(大豆Lectin基因)的兩端，此標(biāo)記的報(bào)告基因與待測(cè)靶基因經(jīng)雜交、缺口補(bǔ)平、環(huán)化后，采用反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增報(bào)告基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的檢測(cè)。結(jié)果：該檢測(cè)體系檢出限低于100CFU/g(mL)，且與其他食源性致病菌的檢測(cè)無(wú)明顯交叉反應(yīng)，對(duì)200份肉制品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為2.5%，與傳統(tǒng)細(xì)菌分離檢測(cè)結(jié)果完全相符。結(jié)論：環(huán)介導(dǎo)間接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以快速、靈敏、特異檢測(cè)肉制品中單增李斯特菌污染。

環(huán)介導(dǎo)間接聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；肉制品；單增李斯特菌

單增李斯特菌是常見(jiàn)的食源性致病菌，可引起食源性李斯特菌病，致死率高達(dá)30%以上[1-4]，被列為21世紀(jì)對(duì)我國(guó)人民衛(wèi)生健康具有重大影響的12種病源微生物之一。自從單增李斯特菌引起的食品中毒事件被首次確認(rèn)以來(lái)[5-6]，人們就致力于對(duì)其檢測(cè)方法的研究[7-9]。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)需要1～2周時(shí)間，人力物力花費(fèi)大，不適宜實(shí)際檢驗(yàn)工作的需要，因此單增李斯特菌的檢測(cè)需要更靈敏、簡(jiǎn)便的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)基礎(chǔ)上建立一種全新的PCR檢測(cè)技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)環(huán)間接PCR，旨在建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中單增李斯特菌的方法，以提高對(duì)細(xì)菌性食物中毒突發(fā)公共衛(wèi)生事件快速反應(yīng)能力及加入WTO對(duì)外食品貿(mào)易發(fā)展的新需要。其基本原理(圖1)是：將兩段相鄰的特異性探針?lè)謩e連接在一段無(wú)關(guān)的報(bào)告基因首尾兩端，帶探針的報(bào)告基因可通過(guò)首尾探針序列與待測(cè)模板互補(bǔ)雜交，從而使其首尾末端靠近，雜交體單鏈缺口經(jīng)DNA聚合酶補(bǔ)平、耐熱連接酶修復(fù)封閉，使報(bào)告基因DNA成環(huán)；再采用報(bào)告基因中間的序列為引物，反向擴(kuò)增含探針的環(huán)狀報(bào)告基因而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的間接檢測(cè)。

圖1 環(huán)介導(dǎo)間接PCR基本實(shí)驗(yàn)原理Fig.1 Principle of loop-mediated indirect PCR

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮豬肉、鮮牛奶 鄭州市購(gòu)；單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株 中國(guó)食品藥品檢定研究院；單增李斯特菌分離株、腸毒性大腸埃希菌分離株、沙門氏菌分離株、大腸埃希氏菌O157∶H7分離株、志賀氏菌分離株和霍亂弧菌分離株 河南省科學(xué)院生物研究所微生物保藏中心(分離鑒定并保存)，質(zhì)粒pMD18-T- Lectin和大腸桿菌JM109則由本實(shí)驗(yàn)室保存。

Chelex-100 resin 美國(guó)bio-rad公司；ExTaq美國(guó)Takara公司；TSBYE 北京經(jīng)科宏達(dá)生物公司；引物的合成有上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

將霍亂弧茵則接種于堿性蛋白胨溶液(含蛋白胨5mg/mL，NaCl 10mg/mL、pH8.3)中，單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株、分離株及其他菌種均接種于TSBYE，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)液1mL，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，涂布于TSA平板，37℃培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。

1.2.2 人工污染樣品的制備

采集市售鮮豬肉25g和鮮牛奶25mL(污染前利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)證實(shí)不含單增李斯特菌)，加入無(wú)菌生理鹽水至250mL，勻漿后加入單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)液，污染程度依次為 10-1、1、101、102、103、104、105CFU/mL，形成人工污染的樣品。

1.2.3 模板DNA的制備

取5mL細(xì)菌培養(yǎng)液，12000×g離心5min棄上清液，沉淀中加入6% Chelex-100 resin 56℃水浴20min，旋渦振蕩2min，煮沸8min，旋渦振蕩2min后立即置冰上冷卻5min，14000×g、4℃離心5min，上清液用作PCR模板；對(duì)于人工污染的肉制品勻漿液，取5mL樣品，先經(jīng)22μm的膜過(guò)濾，收集濾液進(jìn)行下步的模板DNA制備操作。

1.2.4 環(huán)介導(dǎo)間接PCR擴(kuò)增體系建立

1.2.4.1 報(bào)告基因的制備

采用常規(guī)PCR以質(zhì)粒pMD18-T-Lectin為模板擴(kuò)增大豆Lectin基因片段用作檢測(cè)的報(bào)告基因，所用引物的5′端進(jìn)行磷酸化修飾，上游引物序列：GGAATGGTGGAGAA CGGTAATTCAAGAAGCCTCATCACA；下游引物序列：GATGGACGATGTGAAATGAGCTTTCACCAGGGTTT AGTT，其中斜體部分為特異性探針，PCR反應(yīng)體系總體積50μL，其中引物10pmol、dNTPs 0.25mmol/L、MgCl21.5mmol/L、質(zhì)粒DNA模板1μL；Taq酶1.5U。擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性5min后，按下列程序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行膠回收純化特異性探針耦聯(lián)的報(bào)告基因。

1.2.4.2 報(bào)告基因環(huán)化及反向PCR

取單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株DNA溶液和制備好的特異性探針耦聯(lián)的報(bào)告基因進(jìn)行報(bào)告基因環(huán)化及反向PCR擴(kuò)增，用于反向PCR擴(kuò)增的引物為報(bào)告基因中間序列，P1：TATC CGG CGTGGTAAACT；P2：CCTCCAACCATGAAACTT，反應(yīng)體系為30μL，其中引物10pmol，dNTPs 0.3mmol/L，10×TaqDNA Ligase Reaction Buffer 3μL，10×ExTaqBuffer 3μL，TaqDNA Ligase 0.3μL，Ex Taq 0.20μL，報(bào)告基因和標(biāo)準(zhǔn)株DNA溶液各3μL。反應(yīng)分3步進(jìn)行：首先，進(jìn)行95℃變性5min；之后按95℃ 50s、60℃ 8min進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；最后按95℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 30s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后立即進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，序列測(cè)定由上海生工生物工程公司完成。

1.2.5 環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)體系的評(píng)估

特異性實(shí)驗(yàn)：以制備的各種菌株的DNA作為模板進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.4.2節(jié)，PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并進(jìn)行T/A克隆，序列測(cè)定由上海生工生物工程公司完成。

敏感性實(shí)驗(yàn)：取單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成 101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，然后采用Chelex法制備模板DNA，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)間接PCR反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)的靈敏度。

人工污染樣品的環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)：將上述不同污染程度的鮮肉和牛奶樣品采用Chelex法進(jìn)行模板DNA制備，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)間接PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.4.2節(jié)。

1.2.6 環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)應(yīng)用

將200份肉制品樣品各25g進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)和傳統(tǒng)微生物檢測(cè)，比較二者之間的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)介導(dǎo)間接PCR擴(kuò)增體系的建立

2.1.1 報(bào)告基因的標(biāo)記

以pMD18-T-Lectin質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在250～500bp之間可見(jiàn)一清晰條帶(圖2)，與378bp的預(yù)期片段大小相符，將此片段回收進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩端為特異性探針序列，中間序列為大豆Lectin基因片段(圖3)，由此說(shuō)明特異性探針耦聯(lián)的報(bào)告基因制備成功。

圖2 報(bào)告基因的標(biāo)記Fig.2 Label result of reporter gene

圖3 標(biāo)記的報(bào)告基因序列Fig.3 Sequence of the labeled reporter gene

2.1.2 報(bào)告基因環(huán)化及反向PCR

單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株的DNA與報(bào)告基因的DNA經(jīng)過(guò)雜交、修復(fù)、連接環(huán)化及反向PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)在500bp附近有一清晰條帶(圖4)，與預(yù)計(jì)的PCR產(chǎn)物440bp大小相符，將該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示該P(yáng)CR產(chǎn)物兩端為大豆Lectin基因片段，而中間為單增李斯特菌hlyA基因片段，與設(shè)想完全一致，由此可說(shuō)明該方法可行。

圖4 報(bào)告基因的反向PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Reverser PCR result of the reporter gene

2.2 環(huán)介導(dǎo)間接PCR擴(kuò)增體系的評(píng)估

2.2.1 特異性實(shí)驗(yàn)

以不同菌株的DNA作為模板進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)間接PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株及分離株在500bp處均有特異性擴(kuò)增片段，與440bp的預(yù)期片段相符，而其他非單增李斯特菌則檢測(cè)不到特異性擴(kuò)增片段，將該片段進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示該P(yáng)CR產(chǎn)物兩端為大豆Lectin基因片段，而中間為單增李斯特菌hlyA基因片段，與設(shè)想完全一致。由此說(shuō)明該方法特異性較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖5 環(huán)介導(dǎo)間接PCR特異性分析Fig.5 Specificity analysis result of loop-mediated indirect PCR

2.2.2 敏感性實(shí)驗(yàn)

用Chelex法從單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)液不同濃度稀釋液制備的模板DNA，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)間接PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果菌液濃度為10CFU/mL時(shí)仍然可以檢測(cè)到目的片段(圖6)，因此環(huán)介導(dǎo)間接PCR對(duì)單增李斯特菌的靈敏度可達(dá)到10CFU/mL。

圖6 環(huán)介導(dǎo)間接PCR敏感性分析Fig.6 Sensitivity analysis result of loop-mediated indirect PCR

2.2.3 人工污染樣品的PCR檢測(cè)

按照1.2.4節(jié)的方法，用Chelex法直接從污染樣品中分離DNA，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)，用1.2g/100mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，人工污染的鮮肉和牛奶檢測(cè)的靈敏度均為10CFU/mL，與純菌懸液檢測(cè)的靈敏度相當(dāng)，通過(guò)計(jì)算可知該方法對(duì)鮮肉制品和牛奶制品檢測(cè)的靈敏度可達(dá)100CFU/g(mL)。

圖7 人工污染樣品的環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Detection result of the artificially contaminated samples by the loop-mediated indirect PCR

2.3 環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)應(yīng)用

將采購(gòu)的200份不同肉制品進(jìn)行單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)，共檢測(cè)出陽(yáng)性樣本5份，陽(yáng)性率為2.5%，環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)結(jié)果采取傳統(tǒng)的培養(yǎng)法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果完全一致，兩種方法檢測(cè)的符合率為100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各種肉制品檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection result of meat products

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一步鏈置換反應(yīng)，將靶基因的檢測(cè)轉(zhuǎn)換為報(bào)告基因的檢測(cè)，由于用到的報(bào)告基因?yàn)榇蠖筁ectin基因，其與各種食源性致病菌遺傳背景差異大，避免了因污染而導(dǎo)致的假陰性和假陽(yáng)性，擴(kuò)增背景單一，與腸毒性大腸埃希菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、志賀氏菌和霍亂弧菌等食源性微生物的檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。另外，由于各種肉制品成分復(fù)雜，且含有較強(qiáng)的PCR擴(kuò)增強(qiáng)抑制因子，使得PCR檢測(cè)單增李斯特菌靈敏度受樣本影響大[10-11]，為了獲得理想而穩(wěn)定的檢測(cè)靈敏度，文獻(xiàn)報(bào)道的各種PCR檢測(cè)方法均需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌[12-13]，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用Chelex結(jié)合膜過(guò)濾分離模板DNA，Chelex-100是一種離子交換樹(shù)脂，可螯合金屬離子，防止高溫對(duì)DNA損傷，在堿性和煮沸條件下促使DNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)，從而達(dá)到既可保護(hù)DNA又能減少PCR擴(kuò)增抑制因子的目的，提高了PCR檢測(cè)靈敏度。在不增菌的情況下，利用該技術(shù)對(duì)模擬的鮮肉和牛奶樣品檢測(cè)靈敏度與純菌液檢測(cè)靈敏度無(wú)異，均低于10CFU/mL，對(duì)應(yīng)于鮮肉制品和牛奶制品檢測(cè)的靈敏度為100CFU/g(mL)，符合國(guó)際上對(duì)食源性單增李斯特菌的檢測(cè)要求，在保證檢測(cè)靈敏度的基礎(chǔ)上縮短了檢測(cè)時(shí)間；對(duì)送檢的200份肉制品進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽(yáng)性樣本5份，與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果一致，但工作量大幅降低，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單增李斯特菌特異、靈敏和快速檢測(cè)，為致病菌的快速排查，防止受到污染的食品擴(kuò)散，阻止可能的單增李斯特菌爆發(fā)性流行提供了可靠的保證。

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Detection ofL. monocytogenein Meat Products Using Chelex DNA Extraction Combined with Loop-Mediated Indirect PCR

ZHENG Ming1，BIAN Chuan-zhou1，LIU Zhong-min2
(1. Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering, Zhengzhou 450011, China；
2. Biology Institute Co. Ltd., Henan Academy of Sciences, Zhengzhou 450008, China)

Objective∶ To develop a loop-mediated indirect PCR method for rapid detection ofL.monocytogenein meat products.Methods∶ Chelex-100 resin was used to directly extract template DNAs from meat products. Two probes targeted the conserved region ofhly Agene ofL.monocytogenewere designed according to the published sequences and used to label the Lectin gene fragment of soybean (reporter gene). After hybridization with target genes, gap filling and cyclization, the reporter gene was amplified by PCR for detecting the target genes. Results∶ The developed detection system showed a detection limit of lower than 100 CFU/g (mL) and had no obvious cross-reactivity with other foodborne pathogenic bacteria. The positive rate of 200 meat product samples was detected to be 2.5%, which was consistent with the result obtained by traditional bacterial separation. Conclusion∶The loop-mediated indirect PCR method allows the rapid, sensitive and specific detection of L.monocytogene contamination in meat products.

loop-mediated indirect PCR；meat products；L. monocytogene

TS201.3

A

1002-6630(2012)10-0190-05

2011-05-11

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110073)

鄭鳴(1975—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸镞z傳學(xué)。E-mail：floatingzm@163.com