不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)二醇型人參皂苷分純效果的影響

鄧小莉，常景玲，寧曉明，吳羽晨

（1.河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)二醇型人參皂苷分純效果的影響

鄧小莉2，常景玲1，*，寧曉明1，吳羽晨1

（1.河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

研究了二醇型人參皂苷在NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等不同無(wú)機(jī)鹽溶液中的溶解度，采用萃取方法分離二醇型人參皂苷，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，確定了二醇型人參皂苷提純所需的最佳無(wú)機(jī)鹽及濃度。結(jié)果顯示采用丙酮-5%CaCl2鹽溶液（體積比6∶1）溶劑系統(tǒng)，萃取分離效果最好，其最高得率可達(dá)93%。

二醇型人參皂苷，無(wú)機(jī)鹽，高效液相色譜檢測(cè)

人參皂苷（Ginsenoside）是人參的主要有效成分[1-4]，是固醇類化合物的一種。依據(jù)皂苷元的不同，可將皂苷分為二醇型和三醇型人參皂苷。兩類皂苷經(jīng)加工可以轉(zhuǎn)化為稀有皂苷。如Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3和Rh2等屬于二醇型稀有皂苷；Re、Rf、Rg1、Rg2和Rh1等屬于三醇型稀有皂苷。稀有皂苷的藥用價(jià)值遠(yuǎn)高于普通皂苷[1，5]。研究證明[6-8]，人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖浸潤(rùn)、對(duì)抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力等作用；人參皂苷Rh1、Rh2具有較強(qiáng)的抗癌作用，其中Rh2抗腫瘤作用最強(qiáng)。由于在自然界中稀有皂苷的含量甚微，從天然人參中提取又非常困難[9-12]。因此有必要分離總?cè)藚⒃碥罩械亩夹秃腿夹驮碥諉误w，以提高稀有皂苷的轉(zhuǎn)化和利用[13-15]。目前，已有的皂苷分離方法均存在操作復(fù)雜、成本較高、分離不徹底等缺陷。由于無(wú)機(jī)鹽溶液能夠改變二醇型人參皂苷各單體在水相中的溶解度。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)二醇型人參皂苷在不同無(wú)機(jī)鹽溶液中的溶解度，采用相關(guān)溶劑系統(tǒng)研究其萃取方法，確定了二醇型人參皂苷提純所需的最佳無(wú)機(jī)鹽及濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二醇型人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rc、Rd、Rg3、Rh2由成都曼斯特公司提供；甲醇、乙醇、氯化鈣、丙酮、正丙醇、異丙醇、異戊醇 均為分析純，北京化工廠；乙腈、磷酸、甲醇 均為色譜純，上海陸忠化工試劑廠；人參總皂苷 中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

LC-2010C型高效液相色譜儀 日本島津；BL610電子精密天平 Sartorius；HH.W 21.600型電熱恒溫水溫箱 北京市光明醫(yī)療器械廠；SHZ-III循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ-600E型超聲波破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確量取適量Rb1、Rc、Rd、Rg3、CK和Rh2標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合后依次梯度稀釋。稀釋后的Rb1、Rc、Rd、Rg3、CK和Rh2濃度見表1。

1.2.2 溶液的配制

表1 人參皂苷不同稀釋濃度Table 1 Different dilution concentration of six ginsenosides

1.2.2.1 無(wú)機(jī)鹽溶液的配制[10]將無(wú)機(jī)鹽NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2由最低濃度至飽和濃度配制出均勻的5個(gè)梯度，每種標(biāo)準(zhǔn)量為10m L。現(xiàn)用現(xiàn)配或密封保存，防止發(fā)生吸水導(dǎo)致濃度變化。

1.2.2.2 皂苷溶液的制備 分別取1.2.2.1配制好的各濃度鹽溶液5m L在40℃恒溫水浴鍋中加熱，5m in后，將稱好的4g皂苷加入鹽溶液中攪拌至完全溶解待用。

1.2.2.3 95%色譜級(jí)甲醇的預(yù)處理 大于99%的色譜級(jí)甲醇和雙蒸水分別經(jīng)0.45μm纖維過濾膜過濾，取5m L雙蒸水于容量瓶用甲醇定容至100m L。

1.2.3 分離過程

1.2.3.1 萃取 將1.2.2.2處理好的皂苷溶液稍冷卻后加入丙酮35m L，在超聲輔助下萃取，靜置分層。

1.2.3.2 重復(fù)萃取 根據(jù)二醇型、三醇型皂苷的性質(zhì)，上層有機(jī)相含三醇型皂苷，收集備用，下層水相含二醇型皂苷。在含二醇型皂苷的水相中加入2.5m L無(wú)機(jī)鹽溶液攪拌溶解后，再加入丙酮15m L攪拌，靜置分層。重復(fù)上述操作5次，合并下層水相，合并上層有機(jī)相。

1.2.3.3 干燥 將萃取分離的二醇型皂苷60℃烘干，稱量。

1.2.3.4 二醇型皂苷脫鹽 取干燥好的二醇型皂苷樣品溶解于20m L乙醇中，0.22μm膜過濾除鹽，60℃烘干，稱量。

1.2.4 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)

1.2.4.1 樣品液制備 取分離得到的二醇型皂苷樣品0.01g，精密稱定，于1m L 95%的甲醇中超聲溶解，經(jīng)0.22μm膜過濾于樣品瓶中待測(cè)。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.05g二醇型人參皂苷單體Rg3、Rb1、Rc、Rd、Rh2，分別于10m L容量瓶蒸餾水定容，準(zhǔn)確吸取0.1m L上述皂苷單體溶液，于2m L容量瓶無(wú)水甲醇定容，0.45μm脂膜過濾。

1.2.4.3 高效液相色譜分析條件 色譜柱C184.6mm× 150mm，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫35℃，流速1m L/m in。流動(dòng)相梯度如下：0～22m in，乙腈（A）∶磷酸水（B）=34∶66；22.01～100min，乙腈（A）∶磷酸水（B）=43∶57，磷酸水濃度為5.88‰[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷Rb1、Rc、Rd、Rg3、CK和Rh2標(biāo)準(zhǔn)曲線HPLC檢測(cè)色譜峰

根據(jù)圖1結(jié)果，利用LC－Solution軟件以測(cè)得的人參皂苷峰面積（Area）為橫坐標(biāo)X，濃度（Conc）為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸處理，得上述皂苷的回歸方程。Rb1：Y= 3.295583e－007X，相關(guān)系數(shù)r=0.9996；Rc：Y=4.380841e－007X，r=0.9994；Rd：Y=3.105281e－007X，r=0.9991；Rg3：Y=2.235923e－007X，r=0.9994743；CK：Y=2.153659e－007X，r=0.9992；Rh2：Y=2.081828e－007X，r=0.9997。結(jié)果表明上述皂苷在相關(guān)范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

利用LC－Solution軟件制得上述六種人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖1 人參皂苷不同稀釋濃度的色譜圖Fig.1 Chromatogram of different dilution concentration of six ginsenosides

圖2 人參皂苷Rb1、Rc、Rd、Rg3、CK、Rh2標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curves of ginsenoside Rb1，Rc，Rd，Rg3，CK and Rh2

2.2 不同無(wú)機(jī)鹽分離效果的比較

NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2各濃度分離二醇型人參皂苷單體的HPLC檢測(cè)出峰時(shí)間見表2。無(wú)機(jī)鹽分離效果最優(yōu)濃度HPLC見圖3。

由表2數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷單體出峰時(shí)間對(duì)比可以看出：15%NaCl、25%KCl、40%MgCl2、5%CaCl2出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷單體的出峰時(shí)間相接近，依此可確定此濃度為各無(wú)機(jī)鹽的最優(yōu)濃度。由圖3結(jié)果通過各峰值位置比較，四種無(wú)機(jī)鹽中5% CaCl2的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品最相近，且與標(biāo)準(zhǔn)品一樣無(wú)雜峰。

表2 不同無(wú)機(jī)鹽分離得到的二醇型單體的出峰時(shí)間Table 2 Appearance time of panoxadiol type ginsenoside by separating different inorganic salts

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽最優(yōu)濃度分離二醇型人參皂苷HPLC圖Fig.3 HPLC of separating panoxadiol type ginsenoside by different inorganic salts

2.3 丙酮、5%CaCl2萃取二醇型人參皂苷HPLC

按丙酮∶5%CaCl2溶液=6∶1萃取二醇型人參皂苷粗品并進(jìn)行HPLC檢測(cè)，色譜圖見圖4。

圖4 丙酮-5%CaCl2溶液萃取二醇型人參皂苷HPLC圖Fig.4 The HPLC of purifying panoxadiol type ginsenoside by organic solvents 5%CaCl2 salt solution

由圖4與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可知，5m in之前為雜峰。各主峰與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間基本一致，二醇型皂苷得到了很好分離。

根據(jù)LC-Solution軟件制得的上述六種人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線得二醇型皂苷含量見表3。

表3 丙酮-5%CaCl2溶液萃取二醇型人參皂苷含量Table 3 Different dilution concentration of five ginsenosides

由表3可知，丙酮-5%CaCl2溶液萃取的各單體含量與人參總皂苷粉各單體的含量接近，得率為87%～98%，最高得率可達(dá)98%。

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)人參皂苷的功能研究非常多，分離提取總皂苷的方法也有大量研究，但分離純化二醇型、三醇型人參皂苷的研究較少。由于稀有皂苷的藥用價(jià)值和生理活性較高，稀有皂苷是從二醇型、三醇型皂苷加工轉(zhuǎn)化獲得的，因此對(duì)二醇型、三醇型人參皂苷的分離轉(zhuǎn)化已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。本研究通過對(duì)二醇型人參皂苷在NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2不同鹽濃度中的丙酮有機(jī)溶劑溶液萃取，確定了CaCl2鹽溶液分離二醇型人參皂苷的用量和方法。

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Effect of different inorganic salts on the purification of panoxadiol type ginsenoside

DENG Xiao-li2，CHANG Jing-ling1，*，NING Xiao-m ing1，WU Yu-chen1

（1.Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China；2.Xinxiang University，Xinxiang 453003，China）

The ob jectwas to determ ine the best inorganic salt and its concentration in purifying panoxad iol type ginsenoside.Different solubilities of panoxad iol type ginsenoside in different inorganic salt solutions were stud ied，inc lud ing NaCl，KCl，CaCl2and MgCl2.Panoxad iol type ginsenoside was separated through extraction. By using the high performance liquid chromatography test，best inorganic salt solution and its concentration were determ ined.The results showed that the best cond ition for extrac ting and separating panoxad iol type ginsenoside was the organic solvents acetone-5%CaCl2salt solution（v/v，6∶1）.The highest yield was 93%.

panoxad iol type ginsenoside；inorganic salt；HPLC

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0260-04

2011－07－26 *通訊聯(lián)系人

鄧小莉（1962-），女，本科，副教授，研究方向：生物工程和生物活性物質(zhì)。

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（082102220001）。