何 嬌，黃廣民*

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228)

毛薯粉漿酶法水解的響應(yīng)面法優(yōu)化及其動(dòng)力學(xué)研究

何 嬌，黃廣民*

(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228)

考察毛薯酶法水解液化條件及對(duì)酶解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。采用液態(tài)高溫α-淀粉酶在高溫下作用于毛薯粉漿，通過(guò)響應(yīng)面法確定毛薯粉漿最佳水解工藝條件，并對(duì)毛薯粉漿酶法水解液化過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表明：加酶量0.15mL/g、水解溫度90℃、pH6.0、毛薯粉漿質(zhì)量濃度70mg/mL、水解時(shí)間50min，毛薯粉漿糖化率可達(dá)55.69%。動(dòng)力學(xué)研究表明，米氏常數(shù)Km＝69.97mg/mL，最大反應(yīng)速率vm=1.413mg/(mL·min)。

毛薯；響應(yīng)面；酶解；動(dòng)力學(xué)

目前化石能源的日趨枯竭，開(kāi)發(fā)新能源已成為各國(guó)競(jìng)相發(fā)展的戰(zhàn)略決策。開(kāi)發(fā)利用生物質(zhì)能源是新能源的重要內(nèi)涵，燃料乙醇是生物質(zhì)能源的重要組成部分。我國(guó)是一個(gè)人多地少的國(guó)家，糧食供給僅處于緊平衡，沒(méi)有富余的糧食可供釀制乙醇，發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)必須堅(jiān)持不與人畜爭(zhēng)糧食的原則。走非糧型燃料乙醇的道路，是我國(guó)開(kāi)發(fā)生物質(zhì)能源的必然選擇。充分利用非糧型高糖、高碳水化合物資源，開(kāi)發(fā)燃料乙醇，對(duì)我國(guó)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)規(guī)模的拓展及可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

毛薯(Dioscorea esculenta (Lour) Burkill)為薯蕷科薯蕷屬藤本植物，有甜薯和蒂薯兩種。蒂薯屬革質(zhì)攀援藤本，蔓長(zhǎng)130～150cm，每株結(jié)薯約10個(gè)。薯塊橢圓或長(zhǎng)圓形，味稍淡而甜，煮熟后難脫皮。甜薯屬攀繞藤本，莖蔓青紫色，蔓長(zhǎng)100～130cm；薯皮革質(zhì)，肉質(zhì)細(xì)軟，糖分高，味甜可口，煮熟后易脫皮。熟吃毛薯能健脾止瀉，益肺滋腎，解毒斂瘡[1]。自古以來(lái)，一直是海南島上居民的農(nóng)家雜糧，一年四季均可食用。海南島優(yōu)越的地理氣候環(huán)境，賦予毛薯速生快長(zhǎng)的條件，現(xiàn)已成為海南省的一大特產(chǎn)。全省年種植面積2.7萬(wàn)畝以上，畝產(chǎn)鮮薯約2500kg。

海南毛薯富含糖和淀粉，適用于制備燃料乙醇。利用毛薯制備燃料乙醇，須先將毛薯淀粉糖化，使其轉(zhuǎn)化為酵母可發(fā)酵的糖類，再接種發(fā)酵制備乙醇。酶法水解具有反應(yīng)條件溫和，催化效率高和產(chǎn)物專一性而被廣泛用于糧食發(fā)酵制備乙醇工業(yè)。工業(yè)上常采用液態(tài)高溫α-淀粉酶將糧食淀粉一次性糊化和液化，再用糖化酶糖化，糖化液經(jīng)接種發(fā)酵就可制備乙醇。毛薯含有大量黏性成分，毛薯淀粉被這些黏性成分包埋，液態(tài)高溫α-淀粉酶很難作用于毛薯淀粉，使其中的淀粉液化，不能簡(jiǎn)單地套用液態(tài)高溫α-淀粉酶液化糧食淀粉制備乙醇的工藝。本實(shí)驗(yàn)擬采用液態(tài)高溫α-淀粉酶在高溫下作用于毛薯粉漿，通過(guò)響應(yīng)面法確定毛薯粉漿最佳水解工藝條件，并對(duì)毛薯粉漿酶法水解液化過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，以期為毛薯的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新采收的毛薯，洗凈、切片、烘干，粉碎至80～100目，得含水量為8%～10%，備用。

苯酚、亞硫酸氫鈉、3,5-二硝基水楊酸、鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸等，所有試劑均為分析純；液態(tài)高溫α-淀粉酶(15183U/mL) 山東棗莊市杰諾生物酶有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

280-型齒爪式粉碎機(jī) 廣州廣萊農(nóng)業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司；721-型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司； 601BS-型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市晨陽(yáng)電子儀器廠。

1.3 毛薯粉中淀粉含量的測(cè)定[2-3]

毛薯粉中淀粉含量的測(cè)定方法按GB/T 5009.9—2003《食品中淀粉的測(cè)定》進(jìn)行。即準(zhǔn)確稱取5.0000g毛薯粉于裝有慢速濾紙的三角漏斗中，用30mL乙醚分?jǐn)?shù)次洗去脂肪，用150mL乙醇分?jǐn)?shù)次洗去糖類，再用100mL水分?jǐn)?shù)次洗滌殘?jiān)?，轉(zhuǎn)入250mL錐形瓶，加入30mL 6mol/L鹽酸，于沸水浴中回流2h，得毛薯淀粉水解液，迅速冷卻，加2滴甲基紅指示劑，分別用氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加20mL乙酸鉛溶液(200g/L)，搖勻，靜置10min，用20mL硫酸鈉(100g/L)溶液除去過(guò)量的鉛。將溶液及殘?jiān)哭D(zhuǎn)入500mL容量瓶，加水稀釋定容。過(guò)濾，棄去初濾液20mL，濾液供測(cè)定用。

準(zhǔn)確吸取5.0mL濾液于100mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻。再準(zhǔn)確吸取1.0mL稀釋液于50mL容量瓶，采用DNS比色法測(cè)定其吸光度，根據(jù)吸光度對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度的回歸方程，計(jì)算出濾液中總還原糖的含量，所得結(jié)果再乘以0.9可得到毛薯中淀粉的含量，實(shí)測(cè)得毛薯粉中淀粉含量為77.87%。

1.4 毛薯粉漿的液化方法[4-8]

1.4.1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制[9-11]

在0～2.0mL范圍，按0.1mL增序，分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶，加入1.5mL DNS溶液，2.0mL蒸餾水，使葡萄糖質(zhì)量濃度分別為0～0.04mg/mL，在100℃水浴中加熱5min，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋定容。選擇1cm比色皿，在480nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。作一元回歸分析，得吸光度對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度的回歸方程為：

1.4.2 毛薯粉漿的液化

分別準(zhǔn)確稱取5.0000g毛薯粉于三頸燒瓶，加入一定量的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液，攪拌成漿狀，調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)膒H值，攪拌中升溫至合適的溫度，加入適量的液態(tài)高溫α-淀粉酶，水解一定時(shí)間，水解液轉(zhuǎn)入250mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，備用。

1.4.3 毛薯粉漿糖化率的測(cè)定方法[12-13]

分別準(zhǔn)確吸取5.0mL毛薯淀粉液于100mL容量瓶，加蒸餾水稀釋定容，搖勻。再準(zhǔn)確吸取1.0mL此稀釋液于50mL容量瓶，加入1.5mL DNS溶液，2.0mL蒸餾水，以沸水浴加熱5min顯色，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋定容，選用1cm比色皿，在480nm波長(zhǎng)處，測(cè)定其吸光度，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)。根據(jù)吸光度對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度的回歸方程，計(jì)算毛薯粉漿的糖化率。

1.4.4 毛薯淀粉液糖化率的計(jì)算[14]

根據(jù)葡萄糖溶液的吸光度對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度的回歸方程：Y＝22.573X－0.0109，可導(dǎo)出毛薯粉漿糖化率的計(jì)算公式為：

式中：DE為毛薯淀粉液糖化率/%；A為糖化稀釋液的吸光度；0.7787為毛薯粉中淀粉含量；n為稀釋倍數(shù)；M為毛薯粉質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 液態(tài)高溫α-淀粉酶水解條件

2.1.1 水解溫度對(duì)毛薯粉漿水解的影響

按照1.4.2節(jié)方法，調(diào)節(jié)粉漿的pH值為6.0，毛薯粉漿質(zhì)量濃度為50mg/mL，加入預(yù)先稀釋20倍的液態(tài)高溫α-淀粉酶0.14mL/g，分別以60～95℃的溫度水解50min。水解液按1.4.3節(jié)方法測(cè)定總還原糖的含量，計(jì)算毛薯粉漿的糖化率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 水解溫度對(duì)毛薯粉漿水解的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis Dioscorea esculenta (Lour) Burkill tubers

由圖1以看出，水解溫度小于85℃時(shí)，毛薯粉漿的糖化率隨著水解溫度的增大呈線性增大；水解溫度為85℃時(shí)，毛薯粉漿的糖化率達(dá)到最大值，說(shuō)明在該溫度下，液態(tài)高溫α-淀粉酶的活力最大；水解溫度大于85℃時(shí)，隨著水解溫度的增大，毛薯粉漿的糖化率幾乎保持不變。這一現(xiàn)象與酶促反應(yīng)的普遍規(guī)律非常吻合。在酶促反應(yīng)中，溫度升高反應(yīng)速度加快與使酶失活這兩個(gè)相反的影響同時(shí)存在。溫度升高，毛薯粉漿中淀粉粒運(yùn)動(dòng)加快，使得酶與淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵的接觸幾率增加，反應(yīng)速度加快。但并非溫度越高越好，若水解溫度過(guò)高，超過(guò)某一范圍時(shí)，酶蛋白將逐漸變性失活，影響反應(yīng)的進(jìn)行。而這個(gè)溫度是酶的最適作用溫度，即毛薯粉漿最適宜的酶解溫度為85℃。

2.1.2 粉漿的pH值對(duì)毛薯粉漿水解的影響

按照1.4.2節(jié)方法，分別調(diào)節(jié)粉漿的pH值為3.6～7.2，以85℃水解，其他條件同2.1.1節(jié)。測(cè)定毛薯粉漿的糖化率，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)毛薯粉漿水解的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on the degree of hydrolysis of Dioscorea esculenta (Lour) Burkill tubers

由圖2以看出，毛薯粉漿的pH值對(duì)液態(tài)高溫α-淀粉酶的活力影響極大。毛薯粉漿pH值小于6.0時(shí)，毛薯粉漿的糖化率隨著粉漿pH值的增大呈線性增大；毛薯粉漿的pH值為6.0時(shí)，毛薯粉漿的糖化率達(dá)到最大值，表明液態(tài)高溫α-淀粉酶在此pH值時(shí)對(duì)毛薯淀粉作用的效果最佳。這與酶的性質(zhì)有關(guān)，即在此pH值，酶的活力最大，pH值高于或低于該值，都會(huì)改變酶的活性中心構(gòu)象，甚至改變酶分子結(jié)構(gòu)使其變性失活。pH值還會(huì)影響淀粉分子的結(jié)構(gòu)形態(tài)，淀粉分子上某些基團(tuán)只有在一定的結(jié)構(gòu)形態(tài)下，才適宜與酶結(jié)合而發(fā)生水解反應(yīng)[13]。因此液態(tài)高溫α-淀粉酶水解毛薯粉漿最佳pH值為6.0。

2.1.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)毛薯粉漿水解的影響

按照1.4.2節(jié)方法，調(diào)節(jié)粉漿pH值為6.0，分別控制毛薯粉漿質(zhì)量濃度為10～130g/mL，其他條件同2.1.2節(jié)，計(jì)算毛薯粉漿的糖化率，其結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 底物質(zhì)量濃度對(duì)毛薯粉漿水解的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis of Dioscorea esculenta (Lour) Burkill tubers

由圖3以看出，毛薯粉漿質(zhì)量濃度小于40mg/mL時(shí)，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，毛薯粉漿的糖化率呈線性增大；毛薯粉漿質(zhì)量濃度達(dá)到40mg/mL時(shí)，酶與底物能完全結(jié)合，水解生成葡萄糖的量達(dá)到最大，毛薯粉漿的糖化率達(dá)到最大值。此后，隨著毛薯粉漿質(zhì)量濃度的增大，毛薯粉漿的糖化率幾乎保持不變。當(dāng)毛薯質(zhì)量濃度大于70mg/mL時(shí)，隨著毛薯粉漿質(zhì)量濃度的增大，毛薯粉漿的糖化率呈線性下降。其原因在于毛薯粉漿質(zhì)量濃度過(guò)高，黏度過(guò)大，流動(dòng)性差，α-淀粉酶在反應(yīng)系統(tǒng)中運(yùn)動(dòng)速度過(guò)慢，酶與淀粉接觸幾率減小，不利于水解反應(yīng)的進(jìn)行。為提高毛薯粉漿的糖化率，毛薯粉漿的最佳質(zhì)量濃度應(yīng)為70mg/mL。

2.1.4 加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量對(duì)毛薯粉漿水解的影響

按照1.4.2節(jié)方法，毛薯粉漿質(zhì)量濃度為70g/mL，分別加入預(yù)先稀釋20倍的液態(tài)高溫α-淀粉酶0.02～0.24mL/g，其他條件同2.1.3節(jié)，計(jì)算毛薯粉漿的糖化率，其結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量對(duì)毛薯粉漿水解的影響Fig.4 Effect of α-amylase amount on the degree of hydrolysis of Dioscorea esculenta (Lour) Burkill tubers

由圖4以看出，液態(tài)高溫α-淀粉酶加酶量小于0.14mL/g時(shí)，隨著加酶量的增加，毛薯粉漿的糖化率呈線性迅速增大；液態(tài)高溫α-淀粉酶加酶量為0.14mL/g時(shí)，毛薯粉漿的糖化率達(dá)到最大值；液態(tài)高溫α-淀粉酶加酶量大于0.14mL/g時(shí)，繼續(xù)增加酶量，毛薯粉漿的糖化率幾乎保持不變。這是因?yàn)榈孜餄舛群愣〞r(shí)，參與酶解反應(yīng)的位點(diǎn)總是一定的，其底物分子中的α-1,4糖苷鍵已被飽和，即使繼續(xù)增加酶量，水解產(chǎn)物的量也不會(huì)發(fā)生變化。所以為節(jié)省成本，液態(tài)高溫α-淀粉酶加酶量應(yīng)為0.14mL/g。

2.1.5 水解時(shí)間對(duì)毛薯粉漿水解的影響

按照1.4.2節(jié)方法，加入預(yù)先稀釋20倍的液態(tài)高溫α-淀粉酶0.14mL/g，水解時(shí)間10～100min其他條件同2.1.4節(jié)，計(jì)算毛薯粉漿的糖化率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 水解時(shí)間對(duì)毛薯粉漿水解的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis of Dioscorea esculenta (Lour) Burkill tubers

由圖5以看出，水解時(shí)間小于50min時(shí)，毛薯粉漿的糖化率隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈線性增大，水解時(shí)間為50min時(shí)達(dá)到最大值；繼續(xù)延長(zhǎng)水解時(shí)間，毛薯粉漿的糖化率幾乎變化不大。據(jù)張國(guó)權(quán)等[15]的蕎麥淀粉耐高溫α-淀粉酶液化工藝條件研究報(bào)道，其主要原因是耐高溫α-淀粉酶對(duì)長(zhǎng)鏈淀粉或糊精水解的速度要比短鏈淀粉速度快，隨著水解的進(jìn)行，淀粉液中短鏈淀粉產(chǎn)物的數(shù)量逐漸增加，水解的速率逐步減慢。另是淀粉中含有α-1,6糖苷鍵，也會(huì)影響酶解速度。因此，為節(jié)約能耗，毛薯粉漿液化水解時(shí)間應(yīng)為50min。

2.2 毛薯粉漿液態(tài)高溫α-淀粉酶水解條件優(yōu)化

2.2.1 毛薯粉漿水解條件響應(yīng)面優(yōu)化[16]

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)分析，影響毛薯粉漿水解的因素諸多。如加酶量、粉漿的pH值、水解溫度、水解時(shí)間、毛薯粉漿質(zhì)量濃度都是影響因素。為優(yōu)化毛薯粉漿的水解條件，利用Design-Expert 7.1.6軟件，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)，分別以加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量(A)、水解溫度(B)、毛薯粉漿的pH值(C)和毛薯粉漿質(zhì)量濃度(D)為自變量，毛薯粉漿的糖化率(Y)為響應(yīng)值。采用4因素5水平的響應(yīng)面分析法，確定最佳水解條件，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 毛薯粉漿酶解條件響應(yīng)面分析因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面模型的建立及顯著性分析[17]

表2 毛薯粉漿酶解條件中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design and corresponding results

中心組合試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，將數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到以毛薯粉漿糖化率為目標(biāo)函數(shù)Y的二次多項(xiàng)回歸方程：

由方程可看出，各因素對(duì)毛薯粉漿糖化率的影響順序?yàn)椋核鉁囟?B)＞粉漿pH值(C)＞加酶量(A)＞毛薯粉漿的質(zhì)量濃度(D)。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of the fitted quadratic regression model

由表3可知，該模型表現(xiàn)為極顯著(P＜0.0001)；失擬性表現(xiàn)為不顯著(P＝0.1775)；R2和RAdj2分別為0.9814和0.9652，說(shuō)明該模型擬合度良好，其響應(yīng)值的98.14%都來(lái)自所選因變量，其模型能很好的反映因變量與響應(yīng)值的關(guān)系；而預(yù)測(cè)擬合度為0.9106，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性良好，其所得預(yù)測(cè)結(jié)果能表現(xiàn)試驗(yàn)的最佳條件。從表中可以看出其中A、B、C、AB、AC、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值值有極顯著的影響(P＜0.01)，D對(duì)相應(yīng)值則差異顯著(P＜0.05)，其他因素AD、BC、CD間的交互影響表現(xiàn)為不顯著(P＞0.05)。

2.2.3 因素的響應(yīng)面分析及最優(yōu)條件的確定[18]

利用Design-Expert軟件，通過(guò)多元回歸方程做出對(duì)毛薯粉漿的糖化率影響極顯著的因素響應(yīng)面圖和等值圖，如圖7所示。

圖7 各因素交互作用對(duì)糖化率值的影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots for the interactive effects of hydrolysis conditions on the degree of hydrolysis of Dioscorea esculenta (Lour) Burkill tubers

從圖7可以看出，糖化率的等值曲線最圓則相互影響最小，而AC的最扁平，則相互影響最大。

圖7a表明，加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量不變時(shí)，毛薯粉漿的糖化率隨著水解溫度的增大而呈線性增大；水解溫度大于92℃時(shí)，毛薯粉漿的糖化率 隨著水解溫度的增大而逐漸減小，故水解溫度為87～92℃，加酶量在0.13～0.15mL/g時(shí)，毛薯粉漿的糖化率達(dá)到最大值。

圖7b表明，加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量不變，毛薯粉漿的糖化率隨著粉漿的pH值增大而呈線性增加，pH值大于6.2時(shí)，毛薯粉漿的糖化率隨著粉漿pH值的增大而逐漸減小；當(dāng)粉漿的pH值為5.8～6.2，加酶量為0.13～0.16mL/g時(shí)，毛薯粉漿的糖化率達(dá)到最大值。

圖7c表明，水解溫度不變時(shí)，毛薯粉漿的糖化率隨著毛薯粉漿質(zhì)量濃度的增大而呈線性增大；毛薯粉漿質(zhì)量濃度大于75mg/mL時(shí)，毛薯粉漿的糖化率隨著毛薯粉漿質(zhì)量濃度的增大而逐漸減小。水解溫度在86～90℃，毛薯粉漿質(zhì)量濃度在62～76mg/mL時(shí)，毛薯粉漿的糖化率達(dá)到最大值。

通過(guò)軟件分析，得到加入液態(tài)高溫α-淀粉酶的量0.15mL/g、水解溫度89.43℃、粉漿pH5.9、毛薯粉漿質(zhì)量濃度為70.7mg/mL、水解時(shí)間50min，毛薯粉漿的糖化率可達(dá)55.61%。取整后得毛薯粉漿最佳水解條件為：加酶量0.15mL/g，水解溫度90℃、粉漿pH6.0、水解時(shí)間50min，毛薯粉漿質(zhì)量濃度為70mg/mL。在該條件下，液態(tài)高溫α-淀粉酶能很好地作用于毛薯粉漿，其糖化率最高，達(dá)到55.69%[18-19]。

2.3 液態(tài)高溫α-淀粉酶水解毛薯粉漿的動(dòng)力學(xué)分析

2.3.1 毛薯粉漿水解動(dòng)力學(xué)模型建立[20-25]

以響應(yīng)面分析法優(yōu)化取整所得的最佳結(jié)果，選擇水解溫度為90℃、毛薯粉漿pH6.0、水解時(shí)間50min、加酶量0.15mL/g，分別考察底物濃度對(duì)液態(tài)高溫α-淀粉酶水解毛薯粉漿的反應(yīng)速率。根據(jù)毛薯粉漿質(zhì)量濃度與毛薯粉漿的糖化率的關(guān)系，分別計(jì)算單位時(shí)間、單位體積內(nèi)總還原糖的生成量，即葡萄糖生成速率。不同毛薯粉漿質(zhì)量濃度酶水解反應(yīng)速率見(jiàn)圖8[26]。

圖8 底物質(zhì)量濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系Fig.8 Relationship between reaction velocity and substrate concentration

從圖8可以看出，反應(yīng)初始時(shí)，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，酶解速率迅速增大，即葡萄糖生成速率呈線性增大；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到一定值，酶完全與底物結(jié)合，此時(shí)葡萄糖生成速率達(dá)到最大值。此后盡管底物濃度不斷增大，反應(yīng)速率卻不再上升而是趨于平緩[27]。反應(yīng)速率(v)對(duì)毛薯粉漿質(zhì)量濃度[S]呈近似的雙曲線關(guān)系，符合表征酶促反應(yīng)特征的米氏方程所繪制的曲線。

以lnv對(duì)ln[S]作圖得到圖9所示直線，可認(rèn)為在加酶后很短的時(shí)間內(nèi)液態(tài)高溫α-淀粉酶水解毛薯粉漿遵循一級(jí)反應(yīng)規(guī)律?？捎妹资戏匠虒?duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

圖9 lnv與ln[S]的關(guān)系Fig.9 Relationship between lnv and ln[S]

Michaelis-Menten方程提出酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行：

式(2)中，液態(tài)高溫α-淀粉酶(E)與毛薯淀粉(S)快速結(jié)合生成絡(luò)合物(ES)，而該絡(luò)合物卻以較慢的速度分解為產(chǎn)物(P)，同時(shí)釋放出酶分子(E)；k1、k2、k3、k4分別代表各步反應(yīng)的速率常數(shù)。

反應(yīng)初期，沒(méi)有反應(yīng)產(chǎn)物[P]或反應(yīng)產(chǎn)物濃度[P]很低，k4可忽略不計(jì)，故第二步反應(yīng)可認(rèn)為是單向不可逆的。由質(zhì)量守恒定律可得到反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型(米氏方程)為：

式(3)中：Km=(k3+k2)/k1，vm=k3[E]總；Km相當(dāng)于液態(tài)高溫α-淀粉酶的活性部位一半被毛薯淀粉占據(jù)時(shí)所需的毛薯粉漿質(zhì)量濃度；vm表示加入酶的量不變時(shí)，液態(tài)高溫α-淀粉酶被毛薯淀粉飽和，反應(yīng)速率所達(dá)到的最大值。

2.3.2 用Wilkinson[28]統(tǒng)計(jì)法求解米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率

Wilkinson統(tǒng)計(jì)法包括非線性二乘法求估算解和泰勒展開(kāi)式求精校解，計(jì)算過(guò)程分兩步，見(jiàn)表4、5。

式(4)(5)中：vm0為最大反應(yīng)速率的估算解；Km0為米氏常數(shù)的估算解。

式中：b1、b2分別為vm和Km計(jì)算過(guò)程中修正常數(shù)。

故本實(shí)驗(yàn)采用Wilkinson 統(tǒng)計(jì)法求解，其結(jié)果為：vm為1.413mg/(mL·min)，Km為69.97mg/mL。

3 結(jié) 論

綜上所述，經(jīng)單因素和響應(yīng)面分析法對(duì)液態(tài)高溫α-淀粉酶水解毛薯粉漿的條件優(yōu)化，建立了毛薯粉漿的糖化率與加入酶的量、水解溫度、毛薯粉漿質(zhì)量濃度、粉漿pH值等各因素之間的二次多項(xiàng)式回歸模型，取整后得毛薯粉漿最佳水解條件分別為：加酶量0.15mL/g、水解溫度90℃、粉漿pH6.0、水解時(shí)間50min、毛薯粉漿質(zhì)量濃度為70mg/mL。在該條件下，其糖化率最高，達(dá)55.69%。液態(tài)高溫α-淀粉酶作用于毛薯粉漿，其酶解反應(yīng)速率遵循一級(jí)反應(yīng)規(guī)律，遵循Michaelis-Menten方程，米氏常數(shù)Km＝69.97mg/mL，最大反應(yīng)速率vm＝1.413mg/(mL·min)。

表4 Wilkinson法求估算解Table 4 Estimated values of vm and Km by Wilkinson method

表5 Wilkinson法求精校解Table 5 Accurate values of vm and Km by Wilkinson method

上述研究結(jié)果表明，液態(tài)高溫α-淀粉酶作用于毛薯淀粉與作用于糧食淀粉一樣，能在高溫下一次性將毛薯淀粉糊化和液化，能將糧食淀粉制備乙醇生產(chǎn)工藝直接應(yīng)用于毛薯淀粉制備乙醇中。這為利用薯蕷科等非糧植物資源制備燃料乙醇提供了依據(jù)，且對(duì)后續(xù)開(kāi)發(fā)利用熱帶淀粉質(zhì)生物資源具有良好的應(yīng)用前景。

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Optimization and Kinetics of Enzymatic Hydrolysis of Dioscorea esculenta (Lour) Burkill Tubers

HE Jiao，HUANG Guang-min*
(College of Food Science, Hainan University, Haikou 570228, China)

The hydrolysis of Dioscorea esculenta (Lour) Burkill Tubers by thermostable alpha-amylase for starch liquefaction was optimized by response surface methodology. Meanwhile, the hydrolysis process was studied kinetically. The results showed that under the optimized hydrolysis conditions: enzyme dosage of 0.15 mL/g, hydrolysis temperature of 90 ℃, hydrolysis pH of 6.0, substrate concentration of 70 mg/mL and hydrolysis time of 50 min, the DE (dextrose equivalent) was 55.69%. The vmand Km were determined to be 1.413 mg/(mL·min) and 69.97 mg/mL, respectively.

Dioscorea esculenta (Lour) Burkill；response surface analysis；enzymatic hydrolysis；kinetics

S216.2

A

1002-6630(2012)16-0077-07

2012-04-09

何嬌(1987—)，女，碩士研究生，主要從事糖及碳水化合物測(cè)定研究。E-mail：hejiao_23@163.com

*通信作者：黃廣民(1957—)，男，研究員，教授，主要從事糖及碳水化合物和生物質(zhì)能源研究。E-mail：hgmin886699@163.com