系統(tǒng)Ⅱ乙烯對采后番茄果實抗冷過程中抗氧化酶的影響

呂勝男，趙瑞瑞，申 琳，趙丹瑩，生吉萍,2,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872；3.北京市西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100011)

系統(tǒng)Ⅱ乙烯對采后番茄果實抗冷過程中抗氧化酶的影響

呂勝男1，趙瑞瑞1，申 琳1，趙丹瑩3，生吉萍1,2,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872；3.北京市西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 100011)

以反義ACS2 番茄、野生型麗春果實和經(jīng)乙烯利處理的反義ACS2 番茄果實分別作為系統(tǒng)Ⅱ乙烯缺失模型、系統(tǒng)Ⅱ乙烯正常合成模型和系統(tǒng)Ⅱ乙烯補償模型，研究系統(tǒng)Ⅱ乙烯對低溫脅迫下氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，麗春果實和經(jīng)乙烯利處理的反義ACS2果實較未處理的反義ACS2果實組冷害指數(shù)低，電解質(zhì)滲透率的增長被抑制，CAT、APX、SOD平均活性水平提高，而兩組的POD活性增長分別被抑制和誘導(dǎo)。這說明系統(tǒng)Ⅱ乙烯能提高CAT、APX、SOD活性水平并調(diào)控POD活性變化，對增強低溫脅迫下番茄果實的抗冷能力有積極作用。

乙烯；抗氧化酶；氧化脅迫；抗冷性；番茄

低溫貯藏能有效抑制采后果蔬的呼吸作用和致病菌的生長，并廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮，但同時也會對冷敏感型果蔬造成傷害。采后果蔬受到低溫脅迫后，多種生理生化代謝失調(diào)，果蔬表面出現(xiàn)水浸斑，凹陷，組織褐變或崩潰，果實不能正常轉(zhuǎn)色，引起腐爛等冷害癥狀[1]，使其失去商品價值。低溫對細(xì)胞造成的傷害主要來源于其引發(fā)的氧化脅迫[2]。正常情況下，植物細(xì)胞可通過多條途徑不斷產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2－·)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)等活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，并且通過由清除活性氧的酶類和非酶類物質(zhì)構(gòu)成的抗氧化系統(tǒng)清除使之處于動態(tài)平衡狀態(tài)[3]。當(dāng)溫度低于冷害臨界點時，植物細(xì)胞內(nèi)的這種平衡會被打破，大量的活性氧積累并以其極強的氧化性對細(xì)胞膜質(zhì)分子、大分子蛋白及其他活性分子造成破壞[4-5]，而抗氧化清除系統(tǒng)則能保護(hù)細(xì)胞延遲或阻止傷害。戴金平等[6]發(fā)現(xiàn)，低溫下經(jīng)冷鍛煉的黃瓜幼苗超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)仍保持高活性從而避免受害，而未經(jīng)低溫鍛煉的幼苗這些酶的活性均下降，導(dǎo)致幼苗受到傷害甚至死亡；Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶(catalase，CAT)、POD活性的高低與番茄果實品種的抗冷性存在正相關(guān)?？梢?，高活性的抗氧化酶有助于植物抵御低溫脅迫，對提高采后果實抗冷過程十分重要。

乙烯在采后果實的抗冷過程中同樣起到重要作用。Dong等[5]用乙烯受體抑制劑1-MCP(1-methylcyclopropene)處理加重了油桃果實冷害、內(nèi)部褐變以及果肉海綿化程度；1-MCP處理也致使‘Shamouti’柑橘和香蕉果實更容易受到低溫脅迫的傷害[8-9]；而500mg/L乙烯利則可減輕5℃貯藏芒果果實冷害發(fā)生[10]?？梢姡蚁τ谥参锉┞对诘蜏丨h(huán)境中抗冷能力的增強能起到重要作用。相反，也有研究表明在部分種類的采后果實中乙烯會降低果實抗冷性。Pesis等[11]用外源乙烯處理梨果實后置于低溫條件下，梨果皮褐色斑點增多、腐爛加速、冷害加重，而1-MCP處理能有效抑制冷害發(fā)生；在呼吸躍變型李果實中降低內(nèi)源乙烯釋放量也可以緩解冷害發(fā)生，而呼吸越變型與非躍變型的采后李果實相比更易受到低溫傷害[12]。產(chǎn)生這種差異的原因在于植物對乙烯的調(diào)控具有敏感的濃度效應(yīng)，高濃度的乙烯反而會加重脅迫傷害。

呼吸躍變型果實成熟和逆境誘導(dǎo)過程中乙烯自我催化大量生成的系統(tǒng)Ⅱ乙烯濃度遠(yuǎn)大于系統(tǒng)Ⅰ乙烯，其在番茄抗冷過程中對抗氧化酶的作用未見報道。番茄ACS2基因在系統(tǒng)Ⅱ乙烯的合成途徑中起主導(dǎo)作用[13]。ACS2的反義抑制會使番茄中乙烯的合成下降99.5%，導(dǎo)致果實的不成熟表型[14]。本實驗采用反義ACS2番茄果實作為系統(tǒng)Ⅱ乙烯缺失模型，同基因型的麗春果實作為系統(tǒng)Ⅱ乙烯正常合成模型，經(jīng)乙烯利處理的反義ACS2番茄果實作為系統(tǒng)Ⅱ乙烯補償模型，分別研究各模型在低溫脅迫下耐低溫脅迫的能力，CAT、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、POD和SOD的活性變化，為掌握系統(tǒng)Ⅱ乙烯在果實抗冷過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

轉(zhuǎn)反義ACS2番茄由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院果蔬采后生物技術(shù)實驗室提供，其野生型品種為麗春(Lycopersicon esculentum cv Lichun)。所用試材播種于自小湯山特菜基地，花期標(biāo)記，于綠熟期采摘。挑選大小均勻、無病蟲害和機械傷的果實作為實驗材料，運至中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院地下冷庫(15℃)預(yù)冷24h后，于3%次氯酸鈉溶液中浸泡2min 進(jìn)行表面消毒，隨后用清水洗凈。處理組用0.04%乙烯利浸泡果實1min，對照組用清水浸泡，自然曬干。處理后的果實貯藏于冷庫中)(4℃±1℃，相對濕度85%)，定期取樣，進(jìn)行酶活測定及冷害指數(shù)統(tǒng)計。

1.2 試劑與儀器

40 %乙烯利水劑 四川國光農(nóng)化有限公司；其他常用試劑和藥品為國產(chǎn)分析純。

20G高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1800型紫外-可見光分光光度計 日本島津制作所；恒溫水浴鍋 北京靖衛(wèi)科學(xué)儀器廠；PB-10型pH計 北京奧多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷害指數(shù)(chilling injury index，CI)

統(tǒng)計采用Ding等[15]的方法，每次從各組中隨機抽取8個果實進(jìn)行冷害指數(shù)統(tǒng)計并加以計算。冷害分級見表1。統(tǒng)計各冷害級別果實個數(shù)后，按下式計算冷害指數(shù)：

冷害指數(shù)＝∑(冷害級別×該級別果數(shù))/(4×總果數(shù))

表1 番茄果實冷害分級表Table 1 Cold injury grading of tomato fruit

1.3.2 電解質(zhì)滲透率的測定

參考Zhao等[16]的方法。

1.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性測定

參照Aebi[17]的方法，略有改動。將1mL 酶液與1mL緩沖液(50mmol/L 磷酸緩沖液, pH7.0)混合，加入1mL 0.1% H2O2，立即混勻，測定在240nm波長處2min 內(nèi)吸光度的變化。一個酶活力單位：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1U，酶比活力以U/g表示。

1.3.4 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定

參照Nakano等[18]的方法，略有改動。3mL反應(yīng)液(50mmol/L pH7.0 磷酸緩沖液，0.1mmol/L H2O2，0.5mmol/L抗壞血酸)加入0.2mL 的酶液啟動反應(yīng)。測定在290nm 波長處1min 內(nèi)吸光度的變化。酶比活力以U/g表示，以1min 內(nèi)A290減少0.1 的酶量為一個活力單位(U)。

1.3.5 過氧化物酶(POD)活性測定

采用愈創(chuàng)木酚法[19]測定，略有改動。37℃酶反應(yīng)底物(1mL 0.1mol/L pH 5.0醋酸緩沖液+1mL 0.1% 的愈創(chuàng)木酚+1mL 0.08% H2O2)加入0.5mL 酶提取液，立即混勻，測定在470nm 波長處3min內(nèi)吸光度的變化。酶活性以U/g表示，以1min 內(nèi)A470減少0.1的酶量為一個活力單位(U)。

1.3.6 超氧化物岐化酶(SOD)活性

采用NBT法[20]，略有改動。3mL酶反應(yīng)液：50mmol/L pH7.8 的磷酸緩沖液(含13mmol/L甲硫氨酸、75μmol/L NBT、4μmol/L核黃素和100nmol/L EDTA)加入200μL酶提取液，光照10min 后，在560nm波長處比色，以抑制NBT光還原50%為一個活力單位(U)。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析與制圖；采用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同模型番茄果實在低溫脅迫下冷害指數(shù)和電解質(zhì)滲透率變化

表2 不同模型番茄果實低溫(4℃)貯藏下的冷害指數(shù)Table 2 Changes in chilling injury index of tomato fruit during cold storage

隨著低溫脅迫時間的增加，3組番茄果實的冷害指均呈上升趨勢，并在25d時上升幅度較大(表2)。貯藏期間，反義ACS2番茄果實冷害指數(shù)高于麗春組，在25d時相差最大，比麗春組冷害指數(shù)高出47.2%(P＜0.05)。貯藏初期，反義ACS2果實的冷害指數(shù)與其乙烯利處理組相比差別不大，但在15d和25d，乙烯利處理組的冷害指數(shù)低于未處理組，僅分別為未處理組的85.8%和80.0%(P＜0.05)。貯藏結(jié)束時，3組果實的冷害指數(shù)均達(dá)到0.94。

電解質(zhì)滲透率反應(yīng)植物細(xì)胞膜受損程度[7]。低溫貯藏15d開始，與反義ACS2組番茄相比，麗春組番茄電解質(zhì)滲透率的增加受到了抑制，經(jīng)過乙烯利處理的反義ACS2處理組番茄中的電解質(zhì)滲透率也低于未經(jīng)處理的反義組果實，并且在15d和35d時差異顯著(P＜0.05)(圖1)。從各組的冷害指數(shù)和電解質(zhì)滲透率的變化情況可見，麗春組和經(jīng)乙烯利處理后的反義ACS2果實對低溫的耐受能力均高于未經(jīng)處理的反義ACS2果實組。

圖1 低溫(4℃)脅迫下麗春、反義ACSZ、乙烯利處理反義ACSZ番茄果實電解質(zhì)滲透率的變化Fig.1 Changes in electrolyte leakage of tomato fruit during cold storage

2.2 不同模型番茄果實在低溫脅迫下過氧化氫酶(CAT)活性變化

圖2 低溫(4℃)脅迫下麗春、反義ACSZ、乙烯利處理反義ACSZ番茄果實過氧化氫酶(CAT)活性變化Fig.2 Changes in CAT activity of tomato fruit during cold storage

麗春組、反義ACS2及其乙烯利處理組的番茄果實CAT活性在低溫貯藏開始時無明顯差異(圖2)。麗春果實CAT活性在低溫5～15d顯著上升，15d時其活性為整個貯藏期的峰值，高出5d時的18.6%(P＜0.05)；15d后CAT活性小幅度下降并維持在較高水平。反義ACS2果實中CAT活性在貯藏前期略有下降，低溫25d才出現(xiàn)峰值，35d時活性又急劇下降。雖然反義ACS2組與麗春組的CAT活性峰值水平相差不大，但反義ACS2番茄果實的峰值出現(xiàn)時間較麗春組遲10d。另外，在整個貯藏期內(nèi)，麗春果實中的CAT活性平均水平也要高于反義ACS2番茄果實組。乙烯利處理后的反義ACS2果實CAT活性在整個低溫貯藏期處于較高水平，在低溫5d時，處理組的CAT活性就出現(xiàn)整個貯藏期活性的高峰，比未經(jīng)處理的反義ACS2果實組活性峰值提前20d出現(xiàn)，并且顯著高于未處理組的峰值(P＜0.05)。15d時該組的CAT活性下降為其峰值的92.3%(P＜0.05)，貯藏中后期(15～35d)，該組的CAT活性又呈現(xiàn)小幅度趨勢。未處理組在5d、15d CAT活性分別低于乙烯利處理組28.1%和22.4%(P＜0.05)。

2.3 不同模型番茄果實在低溫脅迫下的抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性變化

圖3 低溫(4℃)脅迫下麗春、反義ACSZ、乙烯利處理反義ACSZ番茄果實抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性變化Fig.3 Changes in APX activity of tomato fruit during cold storage

麗春果實APX活性在貯藏初期最高，低溫5～15d時下降，15d后又呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(圖3)。在低溫貯藏前期，反義ACS2果實中APX活性低于麗春組，5d和15d 時差異顯著(P＜0.05)；25d 時反義ACS2果實中APX活性才上升至與麗春組在5d時的活性水平相當(dāng)，但貯藏后期反義ACS2果實組APX活性又呈現(xiàn)下降趨勢。乙烯利處理后的反義ACS2番茄果實中APX活性在低溫15d時顯著上升并出現(xiàn)峰值(P＜0.05)，比未處理組在25d出現(xiàn)的峰值提前10d，并高出86.1%(P＜0.05)。處理組的APX活性在貯藏末期35d 仍有小幅度上升趨勢。未處理組除了在25d峰值及以后的時間與處理組無顯著差異，貯藏前期APX活性均顯著低于處理組(P＜0.05)。2.4 不同模型番茄果實在低溫脅迫下的過氧化物酶(POD)活性變化

圖4 低溫(4℃)脅迫下麗春、反義ACSZ、乙烯利處理反義ACSZ番茄果實過氧化物酶(POD)活性變化Fig.4 Changes in POD activity of of tomato fruit during cold storage

低溫脅迫下，3組果實的POD活性變化趨勢各不相同(圖4)。麗春果實組POD活性在低溫15d時活性水平顯著增加，為5d 時的1.7倍(P＜0.05)，隨后貯藏中其活性變化不大。反義ACS2果實POD活性在15d 時顯著下降(P＜0.05)，與麗春果實組POD活性相當(dāng)，15d后又呈現(xiàn)上升趨勢。低溫貯藏期內(nèi)，反義ACS2果實中POD活性的平均水平要高于麗春組。反義ACS2果實經(jīng)過乙烯利處理補償系統(tǒng)Ⅱ乙烯后，其POD活性在低溫5d前上升，隨后下降，15d后又開始上升，該組的POD活性在5、15、35d時顯著高于未處理組(P＜0.05)。未處理組POD活性在5、15、35d時僅分別為處理組活性的84.5%、63.3%和79.3%(P＜0.05)。

2.5 不同模型番茄果實在低溫脅迫下的超氧化物岐化酶(SOD)活性變化

低溫脅迫初期，麗春組SOD活性小幅度上降，5d后其活性呈現(xiàn)下降趨勢，25d時其活性已經(jīng)下降為5d時的56%(P＜0.05)。貯藏35d時，麗春組的SOD活性又上升至與5d時的水平相當(dāng)(圖5)。反義ACS2果實組SOD活性在低溫脅迫前期顯著下降(P＜0.05)，15d 后其變化趨勢與麗春番茄中的SOD活性變化趨勢較為相似，先下降，25d時活性最低，后期又呈現(xiàn)上升趨勢。盡管在35d貯藏結(jié)束時兩組的SOD活性基本相當(dāng)，麗春果實中的SOD活性在低溫脅迫5d開始要高于反義ACS2果實組，并且這種差異在低溫第5天時顯著(P＜0.05)。乙烯利處理組的反義ACS2果實SOD活性在5～15d時上升，隨后下降，貯藏末期25～35d 時繼續(xù)上升，35d時其SOD活性比5d時的高32.6%(P＜0.05)。未處理組的SOD活 性總體水平低于處理組，并且在35d時顯著低于處理組(P＜0.05)。

圖5 低溫(4℃)脅迫下麗春、反義ACSZ、乙烯利處理反義ACSZ番茄果實超氧化物岐化酶(SOD)活性變化Fig.5 Changes in SOD activity of of tomato fruit during cold storage

3 討 論

由各組番茄的冷害指數(shù)和電解質(zhì)滲透率的變化可知，低溫下反義ACS2果實系統(tǒng)Ⅱ乙烯的合成缺失使其較系統(tǒng)Ⅱ乙烯正常合成的麗春果實遭受了更嚴(yán)重的低溫傷害，用乙烯利處理補償系統(tǒng)Ⅱ乙烯的反義ACS2果實抗冷能力也高于反義ACS2組。這證明對于番茄而言，系統(tǒng)Ⅱ乙烯正向調(diào)控番茄的抗冷能力。這與陳鑫瑤等[21]的結(jié)論相符，內(nèi)源乙烯的生物合成對番茄抵御低溫的過程有積極作用。

氧化脅迫是植物組織對低溫脅迫的一種早期響應(yīng)，由各種抗氧化酶相互協(xié)同完成活性氧的清除：首先SOD通過歧化反應(yīng)清除O2－·生成無毒的O2和毒性較低的H2O2，后者再被CAT、POD或APX還原為H2O，從而限制O2－·與H2O2反應(yīng)生成毒性更強的·OH[2,22]。各種抗氧化酶酶活水平和峰值出現(xiàn)時間影響番茄對低溫脅迫的耐受程度，酶活水平越高、對細(xì)胞的保護(hù)越好，果實受到的低溫傷害越小。除POD外，系統(tǒng)Ⅱ乙烯正常合成的麗春果實組CAT、APX、SOD活性在低溫下誘導(dǎo)上升出現(xiàn)高水平酶活的時間較系統(tǒng)Ⅱ乙烯缺失的反義ACS2果實的早，并且SOD峰值水平也高于反義ACS2組。經(jīng)過乙烯利補償系統(tǒng)Ⅱ乙烯的反義ACS2果實組出現(xiàn)了同樣的情況，3種酶的高峰也要早于未經(jīng)補償?shù)姆戳xACS2果實組或誘導(dǎo)了更高的活性水平的出現(xiàn)。另外，在貯藏末期麗春組和乙烯利處理反義ACS2組這3種酶的活性也都呈現(xiàn)上升趨勢。以上說明系統(tǒng)Ⅱ乙烯在受低溫脅迫的果實中能夠提前CAT、APX、SOD高水平的活性到來時間或增強其酶活水平，這也是反義ACS2果實組冷害指數(shù)高于其他兩組的原因。乙烯利處理的反義ACS2組POD活性平均水平高于未經(jīng)處理的反義組，說明補償系統(tǒng)Ⅱ乙烯后誘導(dǎo)了POD活性的增強，與其抗冷能力正相關(guān)。而麗春組的POD活性在低溫貯藏期間大部分時間內(nèi)反而顯著低于反義ACS2果實組(P＜0.05)，在櫻桃番茄[23]、黃瓜[24]、檸檬[25]、桃[26]果實中也發(fā)現(xiàn)過同樣的現(xiàn)象，抗冷能力強的果實中POD活性反而受到抑制。低溫脅迫下POD 變化的不確定性，可能與POD功能多樣性有關(guān)，POD除了能減少代謝自由基，也參與活性氧的產(chǎn)生和膜脂過氧化[27]，但POD活性變化對植物抗冷能力影響的作用機制仍需進(jìn)一步探索。

由以上可見，系統(tǒng)Ⅱ乙烯對低溫脅迫下果實抗氧化酶系統(tǒng)具有重要的調(diào)控作用，進(jìn)而增強番茄果實的抗冷能力。但是系統(tǒng)Ⅱ乙烯在番茄抗冷過程中對其他生理生化過程和抗冷過程相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控情況如何，仍有待進(jìn)一步研究。

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Effect of System-2 Ethylene on Antioxidant Enzyme Activities in Cold Resistance Process of Tomato Fruits

To analyze the effect of system-2 ethylene on the activities of catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD) during exposure to cold stress, anti-sense ACS2, wild-type Lichun and ethephon-treated anti-sense ACS2 tomato fruits were used to the models of non-system-2 ethylene synthesis, normal system-2 ethylene synthesis and compensative system-2 ethylene synthesis, respectively. It was indicated that wild-type Lichun and ethephon-treated anti-sense ACS2 tomato fruits decreased chilling injury index, inhibited the increase of electrolyte leakage and increased the average activities of CAT, APX and SOD compared with native anti-sense ACS2 tomato fruits. The increase of POD activity was inhibited in wild-type Lichun but induced in ethephon-treated anti-sense ACS2. From these results, it can be concluded that system-2 ethylene can improve the cold resistance of tomato during exposure to cold stress by increasing CAT, APX and SOD activities and regulating POD activity.

ethylene；antioxidant enzymes；oxidative stress；cold resistance；tomato

TS255.3

A

1002-6630(2012)08-0296-05

2011-04-11

國家自然科學(xué)基金面上項目(31071623；30972065)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200803033)

呂勝男(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為果蔬采后生理與食品生物技術(shù)。E-mail：lvshengnan06@gmail.com

*通信作者：生吉萍(1967—)，女，教授，博士，研究方向為果蔬采后生理與生物技術(shù)。E-mail：pingshen@cau.edu.cn