林娜 陳津 付云烽 施小華 王慶華 譚建明

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞。近年來(lái)，干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病和創(chuàng)傷等各種疾病的研究[1]。臍帶來(lái)源廣泛，取材方便，易于采集保存。臍帶采集對(duì)于新生兒及產(chǎn)婦均無(wú)任何痛苦和不良作用，臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs）已成為近年研究的新熱點(diǎn)。在UC-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)同一根臍帶分離出的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在不同開(kāi)關(guān)箱次數(shù)情況下，P3代培養(yǎng)3 d，臍帶間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，相同細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和質(zhì)量存在差異。本文主要探討大規(guī)模培養(yǎng)MSCs?過(guò)程中頻繁開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱造成溫度和CO2濃度的變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響，報(bào)道如下。

材料和方法

一、臍帶來(lái)源

臍帶取自福州總醫(yī)院2009年9月至2010年9月健康足月產(chǎn)新生兒，病原學(xué)檢查陰性，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意后無(wú)菌留取。

二、儀器試劑

CO2溫培養(yǎng)箱?（日本，SANYO公司），LGDMEM培養(yǎng)基?(美國(guó)，Hyclone公司)，胎牛血清FBS(美國(guó)，Hyclone公司)，75 cm2培養(yǎng)瓶?（美國(guó)，Costar公司），0.25﹪胰酶(美國(guó)，Gibco公司)。

三、UC-MSCs?的分離與培養(yǎng)

取新鮮足月產(chǎn)新生兒臍帶，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，剔除動(dòng)靜脈，分離出沃頓膠，0.1﹪Ⅳ膠原酶消化過(guò)夜，0.25﹪胰酶消化60 min，離心洗滌，用含10﹪胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基接種，培養(yǎng)72 h換液，以后每3 d換液1次，長(zhǎng)到80﹪融合時(shí)，用0.25﹪胰酶消化、傳代。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。

四、開(kāi)關(guān)箱實(shí)驗(yàn)

取 P3代細(xì)胞，以 2×105/75 cm2的密度接種，分成7組，每組6瓶細(xì)胞，置于7個(gè)37℃、5﹪ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)照組培養(yǎng)過(guò)程中不開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱，其它6組分別模擬培養(yǎng)操作中不同的開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱次數(shù)（每天5次、10次），以及每次不同的開(kāi)箱時(shí)間（1、2和3 min）。第4天取出，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及密度分布，0.25﹪胰酶消化，600×g離心5 min，重懸計(jì)數(shù)，比較細(xì)胞增殖情況。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，?對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以± s的形式表示，各組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析（ANOVA），以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞形態(tài)觀察

鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和分布，對(duì)照組 UCMSCs?為梭形或不規(guī)則多邊形，呈魚(yú)群樣分布，細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞折光性強(qiáng)，高倍鏡下，胞漿內(nèi)空泡極少或未見(jiàn)空泡；開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱組細(xì)胞大小不均，高倍鏡下，細(xì)胞胞漿內(nèi)空泡數(shù)量增多，隨著開(kāi)關(guān)箱次數(shù)增多和時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)越差。（圖1）

圖1 顯微鏡下各組UC-MSCs形態(tài)比較圖（×200倍）

二、細(xì)胞數(shù)量比較

正常對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)為（5.30 ± 0.08）× 106。所有實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比較，細(xì)胞增殖數(shù)量均明顯減少。開(kāi)關(guān)箱培養(yǎng)組中，相同開(kāi)箱次數(shù)，隨著每次開(kāi)箱時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞增殖速度減慢，不同組細(xì)胞增殖數(shù)量之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =262.50，F(xiàn) =1434.62，P =0.00，P =0.00）；同樣開(kāi)箱時(shí)間條件下，每天開(kāi)箱10次比5次細(xì)胞增殖數(shù)減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?（t =16.40，t =17.28，t =4.48，P =0.00，P =0.00，P =0.00）；在開(kāi)箱 10次，每次3 min的細(xì)胞圖片上明顯看到細(xì)胞片狀死亡脫落（倒置顯微鏡下×100倍）。（表1，圖2，3）

圖2 各組臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量比較

表1 開(kāi)箱時(shí)間和次數(shù)對(duì)細(xì)胞增殖的影響（106，±s）

表1 開(kāi)箱時(shí)間和次數(shù)對(duì)細(xì)胞增殖的影響（106，±s）

注：5次，10次的對(duì)照組均為正常培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

次數(shù) 對(duì)照 1 min 2 min 3 min F?值 P?值5 次 5.3 ± 0.08 4.50 ± 0.14 3.9 0± 0.08 3.27 ± 0.19 262.50 0.00 10 次 5.3 ± 0.08 3.48 ± 0.06 3.15 ± 0.07 2.90 ± 0.07 1434.61 0.00 t?值 16.40 17.28 4.48 P?值 0.00 0.00 0.00

圖3 顯微鏡下各組UC-MSCs 數(shù)量比較圖(×40 倍)

討 論

MSCs?除具有參與構(gòu)成造血微環(huán)境外，還具有多向分化潛能[2]，可分化為骨、脂肪、軟骨和肌肉等，參與機(jī)體的生長(zhǎng)與損傷的修復(fù)過(guò)程[3]。研究人員不僅在骨髓中分離培養(yǎng)出骨髓MSCs，近年來(lái)從臍帶中也分離培養(yǎng)出 MSCs[4]。UC-MSCs?以取材方便、無(wú)創(chuàng)傷、沒(méi)有倫理問(wèn)題且生長(zhǎng)曲線短等優(yōu)點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)[5]。UC-MSCs具有MSCs的表面標(biāo)志，CD10、CD13、CD29、CD44、CD90、CD166、CD106、SH2(CD105)和HLA-l陽(yáng)性，CD14、CD33、CD56、CD31、CD34、CD45 和?HLA-DR?陰性[5]。SH2、CD106和HLA-l表達(dá)低于骨髓源性MSCs，第8代UC-MSCs只有少數(shù)表達(dá)SH2和CD49。MSCs的CFU-F頻率、增殖能力和神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力均高于骨髓MSCs，使它成為更理想的細(xì)胞治療的種子細(xì)胞[7]。如何短時(shí)間內(nèi)獲取大量功能狀態(tài)良好的MSCs并維持其原始狀態(tài)以及控制MSCs分化方向是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。在UCMSCs培養(yǎng)過(guò)程中，本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖速度和形態(tài)差異性很大，同等復(fù)蘇或傳代條件下的細(xì)胞達(dá)到80﹪融合的時(shí)間存在差異。影響MSCs生長(zhǎng)、功能狀態(tài)及分化的因素很多，包括分離方法[8]、CO2濃度、pH值、溫度、生長(zhǎng)因子、血清、培養(yǎng)基、剪切力和細(xì)胞密度等。本研究排除了試劑、細(xì)胞種植密度和操作等因素，考慮在細(xì)胞培養(yǎng)中可能引起細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量差異的是開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱引起溫度和CO2的降低。CO2分壓能夠維持培養(yǎng)液的pH值在一定的范圍，zhao等[9]研究表明，體外細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞可耐受pH值6.0～8.0，但當(dāng)CO2分壓降低，培養(yǎng)液pH值> 7.6后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯受影響。

本研究在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，要定期檢測(cè)培養(yǎng)箱的溫度和CO2濃度，應(yīng)盡量控制培養(yǎng)箱的溫度和CO2濃度的穩(wěn)定，避免頻繁開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱引起溫度和CO2濃度的降低，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢和細(xì)胞分化?？刂萍?xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)箱溫度和CO2濃度的穩(wěn)定能縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高細(xì)胞質(zhì)量，減少培養(yǎng)成本，保證細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)，讓?UC-MSCs更好地應(yīng)用于臨床研究。

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