靈芝螺旋藻片免疫調(diào)節(jié)功能研究

賈福懷，邢曉偉，袁 媛，黃雪敏

（寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012）

靈芝藥用在我國已有2000多年歷史，具有益氣血、安心神、健脾胃的功效，主虛勞，心悸，失眠，頭暈[1]。古今皆以為瑞草，仙草。靈芝含有122種三萜類成分，另外還含有靈芝多糖、核苷酸類、生物堿類等活性成分[3]。靈芝孢子粉是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細(xì)胞即靈芝的種子，是靈芝的精華部分，集中了靈芝的全部有效成分，具有抗癌、增強(qiáng)免疫力、降血脂、降血糖、清除自由基、抗衰老等作用。螺旋藻屬于藍(lán)藻門中的螺旋藻屬，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖類、β－胡蘿卜素、維生素、微量元素、礦物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，螺旋藻具有明顯提高抗應(yīng)激能力、促進(jìn)造血功能、升高白細(xì)胞及增強(qiáng)免疫功能作用[4]。

本試驗(yàn)根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）規(guī)定的增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法，使用御坊堂牌靈芝螺旋藻片通過小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DHT）驗(yàn)證增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；通過小鼠半數(shù)溶血值（HC50）測定和抗體生成細(xì)胞數(shù)檢測驗(yàn)證增強(qiáng)體液免疫功能，通過單核－巨噬細(xì)胞廓清實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證非特異性免疫功能的強(qiáng)弱，來觀察靈芝螺旋藻片免疫調(diào)節(jié)的功能作用。

1 資料與方法

1.1 樣品

靈芝螺旋藻片，灰綠色片，破壁靈芝孢子粉、螺旋藻及少量輔料壓制而成，由寧波御坊堂生物科技有限公司提供，批號(hào)20091201。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級(jí)ICR雄性小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK－（吉）2007003。

1.3 劑量與分組

各選健康雄性小鼠192只，體重18～22g，分16組，每組12只，每4組做一個(gè)實(shí)驗(yàn)，分別為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、抗體生成細(xì)胞數(shù)、半數(shù)溶血值、單核－巨噬細(xì)胞廓清影響試驗(yàn)。灌胃劑量按人體推薦攝入量的1倍、10倍、30倍即0.083、0.83、2.5g／kg BW。

1.4 主要儀器設(shè)備

電子天平（0.1g）、分析天平、游標(biāo)卡尺、722分光光度計(jì)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法DTH）

取羊血，生理鹽水洗滌3次，小鼠用2%（V／V）SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL（約1×108個(gè)SRBC）。在免疫后4天，測量左后足跖厚度，然后在測量部位皮下注射20%（V／V）SRBC，每只鼠20μL（約1×108個(gè)SRBC），注射后24h測量左后足跖厚度。同一部位測量3次，取平均值。

1.5.2 抗體生成細(xì)胞數(shù)（Jerne改良玻片法）

綿羊頸靜脈取血對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，然后，按試驗(yàn)規(guī)程處理后肉眼觀察玻片上的空斑，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.5.3 半數(shù)溶血值測定

取羊血，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，然后，按試驗(yàn)規(guī)程處理后在540nm處以對(duì)照管作空白，分別測定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下式計(jì)算。

1.5.4 單核－巨噬細(xì)胞碳廓清影響試驗(yàn)

小鼠尾靜脈注射1∶4倍稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。注入墨汁2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并立刻將其加到2mL0.1%碳酸鈉溶液中。用722分光光度計(jì)在600nm波長處光密度值（OD），以碳酸鈉溶液做陰性對(duì)照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重，按下式計(jì)算吞噬指數(shù)α：

2 結(jié)果

2.1 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠體重和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響

由表1可見，經(jīng)口給予靈芝螺旋藻片30天，各劑量組小鼠增重在低、中、高劑量組和陰性對(duì)照組間比較無顯著性差異（P＞0.05）；其足趾腫脹度在低劑量組與陰性對(duì)照組間無顯著性差異（P＞0.05），在中劑量組與陰性對(duì)照組間比較有顯著性差異（P＜0.05），在高劑量組與陰性對(duì)照組間比較有高度顯著性差異（P＜0.01）。中、高劑量組的靈芝螺旋藻片能增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。

表1 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠體重和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DHT）的影響（）

表1 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠體重和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DHT）的影響（）

注：P1：各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較；P2：各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較。＊：與陰性對(duì)照組比較P＜0.05；＊＊：與陰性對(duì)照組比較P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 始重（g） 終重（g） 增重（g） P1 足趾腫脹度（mm） P2陰性對(duì)照 12 19.2±1.2 36.3±1.3 17.0±1.6 —— 0.50±0.09——低劑量組 12 19.1±0.9 36.6±1.1 17.5±1.5 0.457 0.55±0.07 0.166中劑量組 12 19.3±0.8 36.7±0.9 17.4±1.1 0.570 0.57±0.09＊ 0.036高劑量組 12 19.4±1.1 37.1±1.3 17.7±1.5 0.265 0.61±0.06＊＊0.002

2.2 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響

由表2可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的靈芝螺旋藻片30天，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其抗體生成細(xì)胞數(shù)在低、中劑量組與陰性對(duì)照組間比較無顯著性差異（P＞0.05）；高劑量組與陰性對(duì)照組比較有高度顯著性差異（P＜0.01），即高劑量組的靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)有明顯的影響。

表2 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響（）

表2 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響（）

注：P：各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較；＊＊：與陰性對(duì)照組比較P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 溶血空斑數(shù)（×103／全脾）P陰性對(duì)照 12 179.5±9.9——低劑量組 12 182.7±12.7 0.461中劑量組 12 186.0±10.0 0.134高劑量組 12 192.0±8.7＊＊0.005

2.3 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響

由表3可見經(jīng)口給予小鼠不同劑量的靈芝螺旋藻片30天，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其半數(shù)溶血值在低、中劑量與陰性對(duì)照組間比較無顯著性差異（P＞0.05），在高劑量與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），即高劑量組的靈芝螺旋藻片能提高小鼠半數(shù)溶血值。

2.4 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠單核－巨噬細(xì)胞碳廓清功能的影響

由表4可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的靈芝螺旋藻片30天，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其碳廓清功能在低劑量組與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），在中劑量組與陰性對(duì)照組間比較有顯著性差異（P＜0.05），在高劑量組與陰性對(duì)照組比較有高度顯著性差異（P＜0.01）。中、高劑量組的靈芝螺旋藻片能提高小鼠單核－巨噬細(xì)胞的碳廓清能力。

表3 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響（）

表3 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響（）

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 溶血空斑數(shù)（×103／全脾）P陰性對(duì)照 12 166±8——低劑量組 12 172±10 0.579中劑量組 12 177±13 0.332高劑量組 12 189±11＊0.042

表4 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠單核－巨噬細(xì)胞碳廓清功能的影響（）

表4 靈芝螺旋藻片對(duì)小鼠單核－巨噬細(xì)胞碳廓清功能的影響（）

注：P：各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較；＊：與陰性對(duì)照組比較P＜0.05；＊＊：與陰性對(duì)照組比較P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 吞噬指數(shù)（a）P陰性對(duì)照 12 6.38±0.33——低劑量組 12 6.68±0.50 0.078中劑量組 12 6.75±0.45＊ 0.031高劑量組 12 6.84±0.32＊＊0.007

3 討論

研究表明，中藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能[5]；螺旋藻中含有的藻藍(lán)蛋白、多糖等，也有提高免疫力[6]。江振友[7]等用靈芝多糖喂藥后兩周，高、中、低3個(gè)劑量組小鼠抗體生成細(xì)胞、高劑量組小鼠血清溶血素（抗體積數(shù)）和對(duì)照組比較均有顯著性差異，表明靈芝多糖對(duì)小鼠的體液免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且與其劑量有密切關(guān)系。

本試驗(yàn)經(jīng)口給予小鼠不同劑量的靈芝螺旋藻片30天，能提高小鼠的半數(shù)溶血值、小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)，即能增加體液免疫功能，能增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，及增加細(xì)胞免疫功能；能提高小鼠單核－巨噬細(xì)胞的碳廓清能力，即增強(qiáng)非特異性免疫功能。說明御坊堂牌靈芝螺旋藻片具有免疫調(diào)節(jié)功能作用。

[1]國家中醫(yī)藥管理局.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[2]衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[M].北京：清華同方電子出版社，2003.

[3]曾祥麗，包海鷹.靈芝三萜類成分與藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].菌物研究，2004，2（1）：68.

[4]陳偉平，王汝俊，劉聲波，等.螺旋藻的化學(xué)成分分析及其藥效學(xué)研究[J].中藥材，2000，23（8）：470-473.

[5]何朝勇，王立為.多糖的免疫調(diào)節(jié)作用綜述[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（4）：62-64.

[6]王文博，高俊萍，孫建光，等.螺旋藻的營養(yǎng)保健價(jià)值及其在預(yù)防醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].中國食物與營養(yǎng)，2009（1）：48-51.

[7]江振友，林晨，劉小澄，等.靈芝多糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2003，24（2）：51-53.