徐 科，黃亞勵(lì)，劉 紅，徐 紅

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004）

熒光光譜法研究氫化可的松與牛血清白蛋白的結(jié)合作用

徐 科，黃亞勵(lì)，劉 紅，徐 紅

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004）

模擬人體p H值，在不同溫度下采用熒光光譜和同步熒光光譜研究了氫化可的松與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用及對(duì)其同步熒光的影響。結(jié)果表明，在p H值7.37的Tris－HCl緩沖溶液中，氫化可的松和BSA彼此擴(kuò)散和碰撞達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡導(dǎo)致BSA熒光猝滅，屬于動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制。計(jì)算得到BSA與氫化可的松在25℃和37℃下動(dòng)態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)分別為1.98105×107L·mol－1·s－1和2.05933×107L·mol－1·s－1。根據(jù)熱力學(xué)方程得出氫化可的松與BSA相互作用的參數(shù)，ΔH＜0、ΔS＞0，說(shuō)明氫化可的松與BSA相互作用以靜電引力為主。氫化可的松加入后，BSA同步熒光光譜（Δλ＝60 nm）的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，表明色氨酸殘基所處環(huán)境的極性增加。

氫化可的松；牛血清白蛋白；動(dòng)態(tài)猝滅；熱力學(xué)參數(shù)

氫化可的松是人工合成也是天然存在的糖皮質(zhì)激素，屬于甾族化合物，是一種常用的消炎藥，主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性發(fā)熱、痛風(fēng)、支氣管哮喘、過(guò)敏性皮炎、脂溢性皮炎、瘙癢癥及腎上腺功能不全所引起的疾病等。但是長(zhǎng)期大量服用會(huì)引起柯興氏癥、水鈉潴留、精神癥狀、消化系統(tǒng)潰瘍、骨質(zhì)疏松、生長(zhǎng)發(fā)育受抑制等病癥。

近年來(lái)，研究藥物分子與血清白蛋白相互作用已成為熱門課題之一［1～3］，對(duì)于闡明藥物的作用機(jī)制和藥代動(dòng)力學(xué)，提高用藥科學(xué)性意義重要。但氫化可的松與牛血清白蛋白（BSA）之間相互作用的研究尚未見報(bào)道。作者討論了在模擬人體生理?xiàng)l件下，氫化可的松與BSA之間的相互作用及對(duì)BSA同步熒光的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司；氫化可的松（國(guó)產(chǎn)）；其它試劑均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

Cary eclipse型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)瓦里安公司；CY－100μL型微量注射器，北京青云卓立精密設(shè)備有限公司。

1.2 方法

氫化可的松儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱量氫化可的松0.2025 g，用乙醇溶解并定容至100 m L，即得濃度為5.587×10－3mol·L－1的儲(chǔ)備液。

配制BSA的儲(chǔ)備液，用p H值7.37的Tris－HCl緩沖溶液定容，得濃度為0.724 mg·m L－1的BSA溶液，置于4℃冰箱中保存。

在10 m L比色管中依次加入0.5 m L BSA溶液、1.0 m L 0.5 mol·L－1的 NaCl溶液、5.00 m Lp H 值7.37的Tris－HCl緩沖溶液，用微量注射器依次加入體積（m L）為 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22的氫化可的松儲(chǔ)備液，用二次蒸餾水定容。熒光比色皿為1 cm，固定激發(fā)波長(zhǎng)為230 nm，入射和出射狹縫為5 nm，分別于25℃和37℃測(cè)定熒光光譜和同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫化可的松與BSA結(jié)合的熒光光譜

固定BSA的濃度不變，改變加入的氫化可的松的濃度，掃描混合溶液的熒光光譜，結(jié)果見圖1。

圖1 氫化可的松對(duì)BSA熒光光譜的影響Fig.1 Fluorescence quenching of BSA by hydrocortisone

從圖1可以看出，在不同溫度下，隨著氫化可的松濃度的增大，BSA在343 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度明顯減弱，出現(xiàn)典型的熒光猝滅現(xiàn)象，說(shuō)明兩者之間存在著相互作用。

2.2 熒光猝滅常數(shù)的測(cè)定

廣義上說(shuō)，任何使熒光強(qiáng)度降低的作用都可以稱為熒光猝滅。導(dǎo)致BSA熒光猝滅的過(guò)程通常存在動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅是化合物和蛋白質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子間的相互碰撞而導(dǎo)致的熒光猝滅，并不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性。靜態(tài)猝滅則通常是由于發(fā)生了配合反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象產(chǎn)生影響，并可能影響其生理活性。動(dòng)態(tài)熒光猝滅遵循Stern－Volmer方程［4］：

式中：F0和F分別為不加入和加入猝滅劑時(shí)體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度；KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（即Stern－Volmer猝滅常數(shù)）；cq為猝滅劑的濃度；Kq為熒光猝滅速率常數(shù)，猝滅劑對(duì)生物大分子的最大Kq一般為2.0×1010L·mol－1·s－1；τ0為熒光物質(zhì)的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命一般為10－8s［5］。

以不同溫度下BSA的熒光強(qiáng)度F0／F比值對(duì)猝滅劑濃度作圖，見圖2。

從圖2可以看出，隨著猝滅劑氫化可的松濃度的增大，F(xiàn)0／F逐漸增大，線性擬合方程的相關(guān)系數(shù)分別為0.9981（25℃）和0.9979（37℃），呈良好的線性關(guān)系。計(jì)算得到25℃和37℃下熒光猝滅速率常數(shù)Kq分別為1.98105×107L·mol－1·s－1和2.05933×107L·mol－1·s－1，因此可以判斷BSA的熒光猝滅是由于BSA和氫化可的松之間彼此擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅。

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的測(cè)定

對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可由結(jié)合常數(shù)表達(dá)式［6］推導(dǎo)求出：

圖2 BSA與氫化可的松相互作用的Stern－Volmer曲線Fig.2 The Stern－Volmer plot of hydrocortisone combined with BSA

式中：n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；KA為結(jié)合常數(shù)。

根據(jù)25℃和37℃下實(shí)驗(yàn)體系的測(cè)量數(shù)據(jù)，以lg［（F0－F）／F］對(duì)lgcq作圖，見圖3。

圖3 lg［（F0－F）／F］與lg cq 關(guān)系曲線Fig.3 The relationship plot of lg［（F0－F）／F］and lg cq

圖3中直線的線性擬合方程以及由直線的斜率和截距求得的不同溫度下氫化可的松和BSA作用的KA和n，見表1。

表1結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Tab.1 Binding constant，binding sites and thermodynamic parameters

2.4 氫化可的松與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

氫化可的松與BSA的動(dòng)態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KD可依據(jù)Lineweaver－Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系式［7］求得：

以（F0－F）－1對(duì)cq－1作圖，求取KD。由于溫度變化不大，將焓變?chǔ)作為常數(shù)，根據(jù)熱力學(xué)公式求出結(jié)合反應(yīng)的自由能變?chǔ)、焓變?chǔ)、熵變?chǔ)，見表1。

Ross等［8］根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)了生物大分子與小分子作用力類型的熱力學(xué)規(guī)律，從氫化可的松與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)看出，ΔH＜0、ΔS＞0，可以推測(cè)該體系的作用力以靜電引力為主。

2.5 氫化可的松對(duì)BSA同步熒光光譜的影響

對(duì)于BSA的同步熒光光譜，Δλ＝15 nm時(shí)為酪氨酸殘基的熒光，Δλ＝60 nm時(shí)則為色氨酸殘基的熒光，因殘基的最大吸收波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，故由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷BSA構(gòu)象的變化：若最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移，表明殘基所處環(huán)境的極性增加，藍(lán)移則表明疏水性增加。實(shí)驗(yàn)表明，氫化可的松的加入對(duì)Δλ＝15 nm時(shí)BSA的同步熒光光譜沒有明顯的影響。氫化可的松加入后Δλ＝60 nm時(shí)BSA的同步熒光光譜見圖4。

圖4 氫化可的松存在下BSA的同步熒光光譜（Δλ＝60 nm，25℃）Fig.4 The BSA synchronous fluorescence spectra in the presence of hydrocortisone（Δλ＝60 nm，25℃）

從圖4可以看出，在不同溫度下，隨著氫化可的松濃度的增大，色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低，BSA同步熒光光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，表明色氨酸殘基所處環(huán)境的極性增加。

3 結(jié)論

模擬人體p H值，在不同溫度下采用熒光光譜和同步熒光光譜研究了氫化可的松與BSA的相互作用。結(jié)果表明，在p H值7.37的Tris－HCl緩沖溶液中，氫化可的松和BSA彼此擴(kuò)散和碰撞達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡導(dǎo)致BSA熒光猝滅，屬于動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制。計(jì)算得到BSA與氫化可的松在25℃和37℃下動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)分別為1.98105×107L·mol－1·s－1和2.05933×107L·mol－1·s－1。根據(jù)熱力學(xué)方程得出氫化可的松與BSA相互作用的參數(shù)，ΔH＜0、ΔS＞0，說(shuō)明氫化可的松與BSA相互作用以靜電引力為主。加入氫化可的松后，BSA同步熒光光譜（Δλ＝60 nm）的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，表明色氨酸殘基所處環(huán)境的極性增加。

［1］ 徐科.氨芐青霉素與牛血清蛋白結(jié)合作用的研究［J］.化學(xué)試劑，2010，32（8）：694－696.

［2］ 徐科，劉紅.熒光分光光度法研究氯霉素與蛋白質(zhì)的相互作用［J］.化工時(shí)刊，2010，24（4）：52－54.

［3］ 潘祖亭，劉義慶，劉小玲.藥物熒光分析法研究進(jìn)展［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，46（6）：674－680.

［4］ Braun A M，Maurette M T.Photochemical Technology［M］.New York：Oliveros，E Wiley，1991：41.

［5］ Lakowicz J R，Weber G.Quenching of fluorescence by oxygen.A probe for structural fluctuations in macromolecules［J］.Biochemistry，1973，12（21）：4161.

［6］ 馮喜增，金瑞祥，何錫文，等.各種離子對(duì)血卟啉與牛血清蛋白相互結(jié)合反應(yīng)的影響研究［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17（6）：866－869.

［7］ 楊頻，楊曼曼，張立偉.熒光法研究咖啡酸類藥物與白蛋白的作用［J］.科學(xué)通報(bào)，1994，39（9）：734－739.

［8］ Ross P D，Subramanran S.Thermodynamic of protein in association reaction：Force contribution to stability［J］.Biol Chem，1981，20（11）：3096－3102.

Study on Binding of Hydrocortisone with Bovine Serum Albumin by Fluorescence Spectroscopy

XU Ke，HUANG Ya－li，LIU Hong，XU Hong
（Department of Chemistry，Guiyang Medical College，Guiyang550004，China）

The binding characteristics of hydrocortisone and bovine serum albumin（BSA）were studied by fluorescence and synchronous fluorescence spectroscopy at different temperatures in simulated human body p H value.The results showed that hydrocortisone had a powerful ability to quench the BSA fluorescence via a diffusion and impact energy transfer mechanism in the Tris－HCl buffer system with a p H value of 7.37.The quenching rate constants，the binding constants and the binding sites of the dynamic quenching were calculated at different temperatures.And according to the thermodynamic parameters calculated，the binding of BSA atΔλ＝60 nm and hydrocortisone was mainly attributed to the electrostatic attraction force.The maximum emission wavelength of the synchronous fluorescence spectrum of BSA had a red shift in the presence of bydrocortisone，indicating that it enhanced the polarity of the environment in which Trp residues existed.

hydrocortisone；bovine serum albumin（BSA）；dynamic quenching；thermodynamic parameter

O 642.1

A

1672－5425（2012）11－0032－04

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.009

黔科合SY字［2011］3128項(xiàng)目資助

2012－07－27

徐科（1978－），女，貴州人，碩士，副教授，研究方向：分析化學(xué)及生物無(wú)機(jī)化學(xué)，E－mail：lilykxu＠163.com。