趨化性細(xì)胞因子CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV－1易感性研究

徐 斌，石 英，惠 威，何佳麗，魏琳琳，王 征，陳德喜

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病內(nèi)分泌科，北京100069）

獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）簡(jiǎn)稱艾滋病，是由 HIV（Human Immunodeficiency Virus）病毒引起的一種傳染性疾病。HIV病毒侵入人體后破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引起一系列嚴(yán)重疾病，病后無特效療法，病死率高。人類第17號(hào)染色體的16個(gè)基因組由兩對(duì)親緣關(guān)系很近的基因組構(gòu)成，即CCL3L—CCL3L1和CCL4—CCL4L1。CCL3和CCL3L1蛋白93個(gè)氨基酸中有88個(gè)相同，這兩個(gè)蛋白均是CCR5受體的配體，在體外試驗(yàn)中均可抑制 HIV－1病毒復(fù)制［1］。影響HIV－1易感性的宿主因素很多，人們由早期對(duì)HLAⅠ等位基因、CCR5和CCR2基因變異的關(guān)注，轉(zhuǎn)向CCR5結(jié)合細(xì)胞因子水平的不同。本研究探討CCL3L1基因拷貝數(shù)不同對(duì)HIV－1易感性的影響，有助于監(jiān)測(cè)個(gè)體對(duì)HIV－1的易感性，對(duì)監(jiān)測(cè)疫苗的有效性具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 健康人群 2005年5月至2006年10月間，北京佑安醫(yī)院血庫(kù)，采集97例健康獻(xiàn)血原的抗凝全血。其中男66例，女31例，平均年齡36±18歲。

1.2 HIV／AIDS患者 2005年5月至2006年10月間，北京佑安醫(yī)院門診或住院的HIV／AIDS患者81例，男性54例，女性27例，平均年齡37±1.2歲。所有患者均為血液傳播感染并未經(jīng)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，病程平均6.2±0.3年。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取 按QIAamp DNA Mini Kit基因組提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CCL3L1基因拷貝數(shù)引物選擇：（1）CCL3L1引物：sense primer：5’－tctccacagcttcctaaccaaga 3’；antisense primer：5’－ctggacccactcctcactgg 3’。（2）管家基因β－globin引物：sense primer：5’－ggcaaccctaaggtgaaggc 3’；antisense：5－ggtgagccaggccatcacta 3’。

以上引物由寶生物公司合成。SYBR反應(yīng)體系：5×SYBR Green 25μl，引物（25μmol／L）2.5 μl，dNTP（10mmol／L）4.0μl，Mg2＋4.0μl，cDNA1.0μl，Taq酶0.25μl，H2O 5μl，10×buffer 5.0μl。反應(yīng)條件：92℃2min預(yù)變性，92℃30s變性，55℃30s退火，72℃30s延伸，35個(gè)循環(huán)，72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。

1.3.3 HIV／AIDS患者血漿中 HIV RNA水平的定量檢測(cè) 采用bDNA法進(jìn)行檢測(cè)。使用德國(guó)Bayer公司的System 340bDNA分析儀，試劑采用廠家配套試劑。

1.3.4 HIV／AIDS患者流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD4＋T細(xì)胞數(shù)量 采用BD公司FACS Calibur Flow Cytometry System，試劑采用BD公司試劑TriTEST CD4／CD8／CD3with TruCOUNT tubes，檢測(cè)分析軟件使用MultiSET自動(dòng)軟件。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件，以是否患HIV－1感染作為因變量，以CCL3L1基因拷貝數(shù)作為自變量經(jīng)logistic回歸分析評(píng)估其與HIV－1易感性的關(guān)系。采用Speraman相關(guān)分析和cubic回歸分析，評(píng)估HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與病毒載量的相關(guān)性。采用直線回歸分析HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)和CD4＋T細(xì)胞計(jì)數(shù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α＝0.05，P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 中國(guó)漢族健康人群和 HIV／AIDS患者CCL3L1拷貝數(shù)分布

中國(guó)漢族健康人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)呈poisson分布，中位數(shù)為0.943329。百份位數(shù)25%和75%分別為0.395930和1.986504。見圖1。

圖1 漢族健康人群和HIV／AIDS患者CCL3L1拷貝數(shù)分布

2.2 CCL3L1基因拷貝數(shù)對(duì)HIV易感性的影響

以健康中國(guó)漢族人群CCL3L1基因拷貝數(shù)的中位數(shù)1為截?cái)嘀?，?yīng)用Logist回歸分析。結(jié)果表明：－2對(duì)數(shù)似然值為221.965，Cox和Snell的R2為0123，Nagellerke的R2為0.164，Hosmer和 Lemeshow的擬合優(yōu)度檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Chi－square為10.563，df為8，p為0.228；Wald統(tǒng)計(jì)量：P 值為0.001＜0.05，OR為0.501，95%可信區(qū)間（0.33～0.761），自變量CCL3L1基因拷貝數(shù)入選，方程分類能力達(dá)57.90%。Logistic回歸的分類概率方程為：

根據(jù)該方程，中國(guó)漢族健康人群CCL3L1平均基因拷貝數(shù)為1，若個(gè)體CCL3L1基因拷貝數(shù)（X）高于漢族健康人群平均基因拷貝數(shù)，這意味著該人不易發(fā)生HIV－1感染，低于漢族健康人群平均拷貝數(shù)者有較高的易感性。

2.3 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與病毒載量的相關(guān)性

應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與病毒載量呈負(fù)相關(guān)性（correlation coefficient＝－0.804，P＝0.000）。

應(yīng)用曲線回歸分析：將病毒載量取Log值后，做曲線評(píng)估，應(yīng)用cubic三次函數(shù)曲線模型R2＝0.639，P 值＝0.000，回歸方程：LogHIV RNA＝5.656－1.397 X－0.988 X2＋0.585 X3（X 代 表CCL3L1基因拷貝數(shù)）。見圖2、3。

2.4 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與CD4＋T細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性

應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)密切正相關(guān)（correlation coefficient＝－0.893，P＝0.000）。

應(yīng)用直線回歸分析得到回歸方程：CD4＋T細(xì)胞數(shù)＝140.805＋423.063×CCL3L1拷貝數(shù)，R值0.869，P值0.000，得到相同結(jié)論。見圖4。

圖2 CCL3L1基因拷貝數(shù)和LogVL Cubic曲線圖

圖3 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與病毒載量分布

圖4 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與CD4T細(xì)胞計(jì)數(shù)分布

3 討論

CCL3L1又稱LD78β，是CD4＋T細(xì)胞的趨化因子，一種93氨基酸的小蛋白，是趨化因子受體CCR5的天然配體之一，CCR5是HIV－1R5株進(jìn)入CD4＋T細(xì)胞的主要輔助受體［2］。

β－趨化因子受體CCR5可以在多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)，包括T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，主要表達(dá)于記憶性T細(xì)胞。既往研究表明CCR5基因變異影響HIV－1的易感性，32堿基的缺失（△－32）如為純合子則對(duì)HIV－1不易感，如為雜合子則宿主的病毒載量很低而且疾病進(jìn)展緩慢［3］。Townson等報(bào)道CCL3L1基因拷貝數(shù)高的個(gè)體，CCL3L1蛋白產(chǎn)物會(huì)更多，并推斷CCL3L1基因拷貝數(shù)目不同會(huì)影響HIV－1的易感性和疾病的進(jìn)展［4］。Gonzalez及其同事在1999年研究也發(fā)現(xiàn)CCR5配體的水平不同也影響HIV－1的易感性和疾病進(jìn)程，從此人們開始關(guān)注CCR5的配體研究，這些配體絕大部分都是細(xì)胞因子［5，6］。高拷貝量CCL3L1可以抑制 HIV感染和疾病進(jìn)程的直接原因：游離細(xì)胞因子可引發(fā)炎癥反應(yīng)，同時(shí)在空間結(jié)構(gòu)上抑制HIVgp120與CCR5結(jié)合。CCL3L1可以影響CCR5的表達(dá)，隨著CCL3L1基因拷貝數(shù)的增加，CCL3LI蛋白激活粒細(xì)胞數(shù)目也會(huì)增加［7］。CCL3L1拷貝數(shù)與T細(xì)胞表達(dá)CCR5的量成反比關(guān)系，體外試驗(yàn)表明，高拷貝CCL3L1作為CCR5調(diào)節(jié)信號(hào)，引起CCR5受體分子內(nèi)陷，造成HIV－1的gp120蛋白不能與CCR5結(jié)合，從而不能進(jìn)入宿主細(xì)胞［8］。

Bugeja等研究268名澳大利亞HIV－1感染者和260名未感染者，以發(fā)現(xiàn)他們所含有的細(xì)胞因子CCL3L1基因水平。研究結(jié)果表明，HIV－1未感染者中CCL3L1陰性率2.3%，CCL3L1水平的高低與 HIV－1 易 感 性 以 及 疾 病 進(jìn) 程 無 相 關(guān) 性［9］。Gonzales等調(diào)查來自57個(gè)民族的1064名健康人的CCL3L1復(fù)制水平，同時(shí)檢測(cè)4308名HIV－1陽(yáng)性非洲裔美國(guó)人、歐洲人、西班牙裔美國(guó)人中CCL3L1基因水平，以發(fā)現(xiàn)不同種族人群CCL3L1基因數(shù)目不同是否影響HIV－1易感性和疾病進(jìn)程。低于同種族CCL3L1平均基因拷貝數(shù)者，對(duì) HIV－1更易感，感染風(fēng)險(xiǎn)率達(dá)39%，感染后疾病進(jìn)展到艾滋病期發(fā)生率增長(zhǎng)26%。高于同種族CCL3L1平均基因拷貝數(shù)者，對(duì)HIV－1不易感，降低風(fēng)險(xiǎn)率4.5%－10.5%［10］。 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 中 國(guó) 漢 族 健 康 人 群 的CCL3L1基因拷貝數(shù)中位數(shù)為1，與歐美種族和非洲裔種族的CCL3L1不同，比他們的CCL3L1平均基因拷貝數(shù)都低。本研究檢測(cè)中國(guó)漢族健康人群97例和HIV／AIDS人群81例CCL3L1基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)低于同種族CCL3L1平均基因拷貝數(shù)者，對(duì)HIV－1更易感，感染風(fēng)險(xiǎn)率達(dá)34.3%。初步探討CCL3L1基因拷貝數(shù)和病毒載量及CD4＋T細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CCL3L1基因拷貝數(shù)和病毒載量呈負(fù)相關(guān)（P＝0.000），CCL3L1基因拷貝數(shù)和CD4＋T細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)（P＝0.000），為探討CCL3L1基因拷貝數(shù)對(duì)HIV／AIDS疾病進(jìn)程的影響奠定基礎(chǔ)。

本研究采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CCL3L1基因拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real time fluorescent quantitative PCR）是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物擴(kuò)增，在對(duì)數(shù)線性擴(kuò)增期能夠迅速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。本研究根據(jù)引物二聚體的CT值、產(chǎn)物及引物二聚體的熔解曲線分析和凝膠電泳對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了CCL3L1的最佳檢測(cè)體系。通過優(yōu)化反應(yīng)條件我們發(fā)現(xiàn)，將讀板溫度設(shè)定在低于T值2－4℃可以提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。就CCL3L1而言，讀板溫度設(shè)定為75℃，低于Tm值溫度3℃，可以促使引物二聚體的雙鏈變性，釋放出結(jié)合的SYBR Green I，降低引物二聚體的熒光信號(hào)的同時(shí)，特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物仍保持復(fù)性狀態(tài)，其數(shù)量直接反映于熒光強(qiáng)度，從而增加檢測(cè)的特異性。

當(dāng)我們知道每個(gè)種族的平均CCL3L1平均拷貝數(shù)后，可以通過細(xì)胞因子CCL3L1基因拷貝數(shù)的不同，判斷個(gè)體HIV－1易感性和疾病進(jìn)展程度。通過對(duì)病人易感性的檢測(cè)，可以幫助臨床醫(yī)生制訂針對(duì)個(gè)體的治療計(jì)劃。并且通過CCL3L1基因拷貝數(shù)的不同，可以判定每個(gè)個(gè)體對(duì)疫苗的應(yīng)答率。這也意味著CCR5配體基因產(chǎn)物對(duì)于HIV－1感染個(gè)體具保護(hù)性，CCL3L1基因拷貝數(shù)高者對(duì)HIV－1感染者的保護(hù)性越大。這項(xiàng)研究揭示了CCL3L1基因拷貝數(shù)個(gè)體的不同影響著HIV－1的感染過程，CCL3L1基因產(chǎn)物與HIV－1易感性密切相關(guān)。

［1］Modi WS.CCL3L1and CCL4L1chemokine genes are located in a segmental duplication at chromosome 17q12［J］.Genomics，2004，83（4）：735.

［2］Hoffman TL，Stephens EB，NarayanO，et al.HIV－1envelope determinants for use of the CCR2b，CCR3，STRL33and APJ coreceptors［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（19）：11360.

［3］Nolan D，Gaudieri S，John M，et al.Impact of host genetics on HIV disease progression and treatment：new conflicts on an ancient battleground［J］.AIDS，2004，（18）：1231.

［4］Townson JR，Barcellos LF，Robert JB，et al.Gene copy number regulates the production of the human chemokine CCL3－L1［J］.Eur J Immunol，2002，32：3016.

［5］Arenzana－Seisdedos F，Parmentier M.Genetics of resistance to HIV infection：Role of co－receptors and co－receptor ligands［J］.Semin Immunol，2006，18 （6）：387.

［6］Gonzalez E，Bamshad M，Sato N，et al.Race－specific HIV－1disease－modifying effects associated with CCR5haplotypes［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96（21）：12004.

［7］Cohen JV.Chemokine gene number tied to HIV susceptibility，but with a twist［J］.Science，2005，307（5706）：23.

［8］Lederman MM，Veazey RS，Offord R，et al.Prevention of vaginal SHIV transmission in rhesus macaques through inhibition of CCR5［J］.Science，2004，306：485.

［9］Bugeja MJ，，Booth DR，Bennetts BH，et al.Analysis of the CCL3－L1gene for association with HIV－1susceptibility and disease progression［J］.AIDS，2004，（18）：1069.

［10］Mackay CR.CCL3L1dose and HIV－1susceptibility［J］.Trends Mol Med，2005，11（5）：203.