魏 偉， 陸大祥， 戚仁斌， 王達(dá)安

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)08-1436-05

2012-05-07

2012-06-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.81100944)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.B2011156)；暨南大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.21611334)

△通訊作者 Tel: 020-85220253; E-mail: rocky1240@163.com

葉酸和維生素B12減輕高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的老年大鼠阿爾茨海默樣病變*

魏 偉△， 陸大祥， 戚仁斌， 王達(dá)安

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

目的探討慢性高同型半胱氨酸血癥對(duì)老年大鼠腦內(nèi) tau 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響以及其可能機(jī)制。方法選取18月齡健康大鼠，尾靜脈注射同型半胱氨酸(Hcy)生理鹽水溶液(1.6 mg·kg-1·d-1)制造高同型半胱氨酸血癥模型組，在給予 Hcy 的同時(shí)通過(guò)飲用水給予葉酸(4 mg·kg-1·d-1) 和維生素B12(Vit B12,250 g·kg-1·d-1)作為治療組，單純注射生理鹽水作為對(duì)照組，持續(xù)28周，Bielschowsky 銀染觀察磷酸化 tau 蛋白的分布和聚集；Western blotting 檢測(cè)磷酸化 tau蛋白、糖原合酶激酶3β (GSK-3β)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的表達(dá)。結(jié)果(1)血漿中 Hcy 水平增高導(dǎo)致神經(jīng)原纖維樣纏結(jié)；給予葉酸和Vit B12能夠有效減輕纏結(jié)；(2)血漿高 Hcy 水平誘導(dǎo)老年大鼠腦內(nèi) tau 蛋白在Ser199/202和Ser396位點(diǎn)磷酸化水平升高；(3)血漿高 Hcy 水平激活 GSK-3β 同時(shí)抑制 PP2A 的活性。補(bǔ)充葉酸和Vit B12有效地緩解了這些激酶和酯酶的活性改變，并下調(diào)了 tau 蛋白 Ser199/202和Ser396位點(diǎn)的磷酸化水平。結(jié)論補(bǔ)充葉酸和Vit B12能夠有效改善高同型半胱氨酸血癥所誘導(dǎo)的 tau 蛋白阿爾茨海默樣病理改變，其機(jī)制可能與其抑制GSK-3β活性和激活PP2A有關(guān)。

老年大鼠； Tau蛋白; 葉酸; 維生素B12; 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的兩大病理學(xué)特征是神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)和主要存在于細(xì)胞外的老年斑(senile plaques, SPs)[1], 神經(jīng)原纖維纏結(jié)主要由異常過(guò)度磷酸化的骨架蛋白 tau 構(gòu)成，但是誘導(dǎo) NFTs 形成的上游效應(yīng)目前還沒(méi)有完全清楚。同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是體內(nèi)提供甲基和轉(zhuǎn)硫作用的關(guān)鍵物質(zhì)，當(dāng)體內(nèi)葉酸和維生素B12[folate and vitamin B12(Vit B12), FB]缺乏時(shí)，血漿 Hcy 水平增高就成為一碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)所需的輔助因子缺乏的直接結(jié)果。眾多臨床調(diào)查表明，血漿 Hcy 水平升高與 AD 的發(fā)生呈正相關(guān)，因此高 Hcy 血癥已被提出作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[2]。Hcy 損壞海馬神經(jīng)元內(nèi)的受損DNA修復(fù)，使神經(jīng)元更易受淀粉樣蛋白毒性損壞[3]。但是高同型半胱氨酸血癥對(duì)老年大鼠 NFTs 的影響直到現(xiàn)在還沒(méi)有報(bào)道。因此本次研究使用24月齡的大鼠(相當(dāng)于人的年齡65歲[4])，探討高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的老年大鼠腦內(nèi)的 tau 蛋白病理改變。我們發(fā)現(xiàn)高 Hcy 血癥可導(dǎo)致tau蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，其機(jī)制包括蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的活性抑制和糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)被激活。同時(shí)補(bǔ)充 FB 可以有效改善高 Hcy 血癥誘導(dǎo)的上述阿爾茨海默氏樣病變。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供的SD大鼠，成年雄性，18月齡，體重(500 ± 20) g，在安靜、室溫25 ℃左右、晝夜節(jié)律12 h∶12 h的環(huán)境下飼養(yǎng)。

2主要試劑

DL-Hcy購(gòu)于Sigma。p-Ser396抗體購(gòu)于Biosource，用來(lái)檢測(cè) Ser396位點(diǎn)的磷酸化tau蛋白。Tau1抗體購(gòu)于Chemicon，用來(lái)檢測(cè) Ser199/202位點(diǎn)的非磷酸化tau蛋白。Tau5抗體購(gòu)于NeoMarkers，用來(lái)檢測(cè) tau蛋白總量。DM1A購(gòu)于Sigma，用來(lái)檢測(cè)α微管蛋白。PP2A-C、p-PP2A-C-Tyr307、GSK3β和p-GSK-3β-Ser9抗體購(gòu)于Cell Signaling，分別用來(lái)檢測(cè)PP2A催化亞基C的總量和其Tyr307位點(diǎn)的磷酸化，GSK3β的總量和其Ser9位點(diǎn)磷酸化。葉酸購(gòu)于Yabang Aipusen，Vit B12購(gòu)于云鵬有限公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白測(cè)定試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗和化學(xué)發(fā)光底物(ECL)試劑盒購(gòu)自Pierce。

3主要方法

3.1AD 樣模型的復(fù)制 Hcy 以生理鹽水配制，濃度為400 mg/L。葉酸和Vit B12片劑研磨后溶于大鼠飲用水中[5]。為了建立老年大鼠高 Hcy 血癥慢性模型，我們對(duì)18個(gè)月齡的大鼠通過(guò)尾靜脈注射 Hcy(400 μmol/L，4 mL/kg，每3 d 1次)作為模型組(Hcy,n=20)，同時(shí)飲用水補(bǔ)充葉酸(4 mg·kg-1·d-1)和Vit B12的(250 μg·kg-1·d-1)作為治療組(Hcy+FB,n=20)，生理鹽水(NS)注射作為對(duì)照組(control,n=20)，注射持續(xù)28周。

3.2高壓液相色譜法測(cè)定 Hcy 的含量[6]高壓液相所用的所有試劑均用Barnstead純水儀所制的超純水配制并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。所采集血用肝素抗凝，血樣于室溫下30 min 內(nèi)分離，3 000×g離心10 min分離血漿。取血漿105 μL加入2.5 mmol/L乙酰半胱氨酸15 μL和SE液(4.5%NaCl，20 mmol/L EDTA)30 μL，振蕩混勻；加入0.6 mol/L 3-丁基磷15 μL混勻，冰浴反應(yīng)30 min。加入0.6 mol/L高氯酸150 μL混勻，室溫放置10 min，5 000×g離心5 min。取上清液25 μL加入0.125 mol/L硼酸緩沖液(pH 9.5)62.5 μL、1.55 mol/L 氫氧化鈉5 μL和SBDF 25 μL混勻后，60 ℃孵育60 min，放人冰水中終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物3 000×g離心3 min，取上清液10 μL 進(jìn)樣作高效液相分析。樣本 Hcy 和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為3.056 min和5.763 min，并能與其它峰有效地分開(kāi)。血漿 Hcy的標(biāo)準(zhǔn)曲線用加入已知量的Hcy到正常血漿中，通過(guò)上述反應(yīng)來(lái)測(cè)定，由加入的 Hcy 濃度對(duì)絕對(duì)峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所加入Hcy的變化范圍為0～45 μmol/L，在此變化范圍內(nèi)，Hcy濃度與絕對(duì)峰面積之間具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9993，Y=0.007819，X=0.0042)。

3.3Bielschowsky銀染[7]大鼠經(jīng)過(guò)灌注、固定后對(duì)腦組織進(jìn)行振蕩切片，厚度為30 μm。切片用PBS洗3×5 min，2%～4%AgNO3，37 ℃避光30 min，ddH2O洗3×5 min，10%甲醛還原5 min至切片微黃，ddH2O洗3×5 min，200 μL/片加入氨銀乙醇液5 min，ddH2O洗3×5 min，常規(guī)脫水、透明、封片。

3.4免疫印跡 取同側(cè)海馬加入400 μL勻漿液(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L NaF, 2 mmol/L Na3VO4·12H2O, 1 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L PMSF， 2.0 mg/L 胃蛋白酶抑制劑)進(jìn)行勻漿、超聲。加入1/3體積的4×上樣緩沖液，煮沸 10 min 使蛋白變性, 4 ℃、12 000 r/ min離心15 min，取上清。BCA法測(cè)定樣品的蛋白含量，各泳道的蛋白上樣總量為30 μg。樣品經(jīng) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維(NC)膜上，將 NC 膜用5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉60 min，加入I抗, 4 ℃孵育過(guò)夜，TBS緩沖液 (Tris 50 mmol/L, NaCl 100 mmol/L，pH 7.5) 沖洗3次。加HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗 IgG (1∶5 000)， 37 ℃孵育膜1 h，TBS漂洗10 min×3次。加ECL顯色液顯色后進(jìn)行曝光、沖洗膠片，掃描分析條帶后保存膠片。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1補(bǔ)充葉酸和VitB12可逆轉(zhuǎn)血漿Hcy水平的升高

使用高效液相色譜法測(cè)定各組老年大鼠血漿中Hcy的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hcy組血漿內(nèi)Hcy水平明顯升高，達(dá)15.2 μmol/L，較control組 8.6 μmol/L明顯升高，表明高Hcy血癥模型制造成功；與Hcy組相比，Hcy+FB組血漿內(nèi)Hcy水平明顯降低至12.6 μmol/L，顯著差異(P<0.05),見(jiàn)表1。這個(gè)結(jié)果表明，葉酸和Vit B12可有效降低血漿內(nèi)Hcy水平。此外，各組大鼠的體重沒(méi)有顯著差異。

表1各組大鼠血漿Hcy和體重的變化

GroupHcy(μmol/L)Weight(g)Control8．6±1．1545±15Hcy15．2±1．2?543±17Hcy+FB12．6±1．1#547±19

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

2血漿高Hcy水平可誘導(dǎo)老年大鼠海馬tau蛋白神經(jīng)纖維樣纏結(jié)

Hcy組在海馬CA3區(qū)細(xì)胞質(zhì)染色增加，而在補(bǔ)充葉酸和Vit B12后染色弱于Hcy組，見(jiàn)圖1。我們還檢測(cè)了大鼠的腦皮質(zhì)染色變化，發(fā)現(xiàn)染色主要分布在細(xì)胞質(zhì)和突起，在Hcy組胞漿染色更深，更重要的是，該突起是蜿蜒而不是直線，在補(bǔ)充葉酸和Vit B12后細(xì)胞質(zhì)的染色變得非常弱，突起變直。

Figure 1. Bielschowsky silver staining of rat hippocampus and cortex. In the CA3 region of hippocampus, the staining was increased mainly in the cytoplasm after 28-week injection of Hcy, while the staining of the cytoplasm in Hcy+FB group became weaker than that in Hcy group and the neurites was also a little stained. In the cortex of the rat brain, the staining was distributed in the cytoplasm and neurites, but it was more deeply stained in the cytoplasma of Hcy group, and the cytoplasma staining became very weak after FB injection. Scale bar = 100 μm.

圖1Bielschowsky銀染檢測(cè)纖維狀纏結(jié)結(jié)構(gòu)

3血漿高Hcy水平可誘導(dǎo)老年大鼠海馬tau蛋白過(guò)度磷酸化

Hcy 組p-Ser396表達(dá)升高，而非磷酸化的 Tau1表達(dá)降低；與Hcy組相比，Hcy+FB組p-Ser396蛋白表達(dá)水平明顯降低，而Tau1表達(dá)水平升高，Tau5(檢測(cè)總tau水平)沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)圖2。這提示高Hcy血癥可誘導(dǎo)tau蛋白在Ser396和Ser199/202位點(diǎn)磷酸化水平明顯增加；補(bǔ)充葉酸和Vit B12可明顯逆轉(zhuǎn)由高Hcy所誘導(dǎo)的tau蛋白多位點(diǎn)磷酸化水平的升高。

4Hcy對(duì)蛋白激酶和磷酸酶活動(dòng)的影響

Hcy注射后GSK-3β和PP2A-C蛋白水平?jīng)]有變化，但GSK-3β在Ser9位點(diǎn)磷酸化(非活性)水平下降，p-PP2A-C-Tyr307(非活性)水平升高，補(bǔ)充葉酸和Vit B12后使上述各指標(biāo)恢復(fù)到正常水平，見(jiàn)圖3。這說(shuō)明高Hcy水平可使GSK-3β活性升高，PP2A活性降低；而補(bǔ)充葉酸和Vit B12后恢復(fù)這些活性的變化。

圖2葉酸和VitB12對(duì)Hcy引起的大鼠海馬tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響

圖3葉酸和VitB12對(duì)Hcy引起的tau蛋白上游激酶和磷酸酶的影響

討 論

隨著年齡的增加，血漿Hcy的濃度逐漸增加[8]，高Hcy血癥已被作為阿爾茨海默氏病的一個(gè)強(qiáng)大和獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[2]，以上研究結(jié)果提示，Hcy血癥和阿爾茨海默病的病變之間可能存在一定聯(lián)系。由于阿爾茨海默病是高發(fā)于老年人的疾病，所以在本次研究中我們通過(guò)構(gòu)建高Hcy血癥老年大鼠模型，研究高Hcy血癥對(duì)大鼠微管相關(guān)蛋白 tau的作用及其可能機(jī)制。tau蛋白是主要的細(xì)胞骨架蛋白之一，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，包含85個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)[9]，在老年癡呆中，這些位點(diǎn)按一定的順序先后發(fā)生磷酸化[10]。作為神經(jīng)纏結(jié)的主要蛋白成分之一，與老年癡呆的遺忘癥狀呈正相關(guān)性[11]。高Hcy血癥能誘導(dǎo)老年大鼠tau蛋白在多個(gè)老年癡呆樣位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化。由于tau蛋白磷酸化會(huì)增加tau不溶性而使tau蛋白聚積而形成纏結(jié)，我們通過(guò)Bielschowsky銀染發(fā)現(xiàn)了過(guò)度磷酸化tau蛋白組成的纏結(jié)樣結(jié)構(gòu)。

由于在老年癡呆病癥中，tau蛋白的過(guò)度磷酸化是蛋白激酶和磷酸酯酶不平衡表達(dá)的結(jié)果，因此，我們檢測(cè)了參與tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)的蛋白激酶GSK-3β和磷酸酯酶PP2A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP2A活性降低而GSK-3β活性增加，這說(shuō)明 PP2A 和 GSK-3β可能參與了高Hcy誘導(dǎo)的tau蛋白過(guò)度磷酸化，但詳細(xì)機(jī)制需要作進(jìn)一步的研究。

Hcy來(lái)自必需氨基酸蛋氨酸，可以再甲基化成蛋氨酸。這種反應(yīng)是由蛋氨酸合成酶催化，這就要求Vit B12作為輔助因子，甲基四氫葉酸作為輔助碳源。通過(guò)補(bǔ)充B族Vit減少血漿Hcy的濃度可能會(huì)提供一些針對(duì)認(rèn)知功能減退的保護(hù)[12]。本次研究結(jié)果證實(shí)了這點(diǎn)推測(cè)。補(bǔ)充葉酸和Vit B12可以降低血漿中Hcy水平，逆轉(zhuǎn)由高Hcy所導(dǎo)致的tau蛋白過(guò)度磷酸化。

Hcy血癥可能以多種方式促進(jìn)癡呆癥的發(fā)病機(jī)制，如通過(guò)腦微血管內(nèi)皮功能障礙，氧化應(yīng)激，β淀粉樣肽的神經(jīng)毒性及神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Hcy的代謝產(chǎn)物磺基Hcy，也可能通過(guò)激活N-甲基-D-天冬氨酸受體造成神經(jīng)元興奮刺激[13]。是否這些機(jī)制在老年大鼠大腦中發(fā)揮相同的功能還需要進(jìn)一步研究。

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ProtectiveeffectoffolateandvitaminB12onAlzheimer-likepathologicalchangesinbrainofagedratswithhyperhomocysteinemia

WEI Wei, LU Da-xiang, QI Ren-bin, WANG Da-an

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou, 510632,China.E-mail:rocky1240@163.com)

AIM: To explore the effect of hyperhomocysteinemia on the Alzheimer-like pathological changes in the brain of aged rat.METHODSThe rats were treated with homocysteine (Hcy) by intravenous injection through vena caudalis with or without a simultaneous supplementation of folate and Vitamin B12(FB) in the drinking water for 28 weeks. The distribution and aggregation of tau protein were detected by Bielschowsky silver staining. Western blotting was used to determine the protein levels of tau phosphorylation, glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) and protein phosphatase 2A (PP2A).RESULTSTreatment with Hcy induced hyperhomocysteinemia in aged rats and resulted in the formation of neurofibrillary tangles in the brain. Supplementation of FB effectively reduced the tangles. Hyperhomocysteinemia also induced Alzheimer-like tau hyperphosphorylation at multiple sites (Ser199/202and Ser396). Hyperhomocysteinemia activated GSK-3β and inhibited the activity of PP2A. Supplementation of FB alleviated the changes of tau and the activities of GSK-3β and PP2A.CONCLUSIONSupplementation of FB ameliorates the hyperhomocysteinemia-induced Alzheimer-like pathological changes of tau protein possibly through regulating the activity of GSK-3β and PP2A in aged rats.

Aged rat; Tau protein; Folic acid; Vitamin B12; Alzheimer disease

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.08.018