鄭蘭榮，邵金貴

皖南醫(yī)學院病理解剖學教研室，安徽蕪湖241002

神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor，NGF)是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它是一種含有118個氨基酸的蛋白質，由一個β亞單位、兩個α亞單位以及兩個γ亞單位以非共價鍵結合形成，其中β亞單位是唯一具有活性的亞基［1］。大量的體外實驗證實它是周圍神經(jīng)系統(tǒng)交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元及中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能神經(jīng)元發(fā)育、分化和行使正常功能必不可少的營養(yǎng)因子［2］。小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最大的運動結構，是比較高級的軀體運動調節(jié)中樞。但是有關小腦胚胎發(fā)育階段NGF陽性神經(jīng)元的發(fā)育目前鮮見報道。因此，本研究應用免疫組織化學方法對胚胎發(fā)育時期小腦內NGF陽性神經(jīng)元的發(fā)生、生長發(fā)育、形態(tài)演變及其分布特征進行較全面觀察，并檢測積分吸光度 (integral absorbance，IA)，以探索其生長發(fā)育規(guī)律。

材料和方法

胚胎收集與分組收集合法的發(fā)育正常、已經(jīng)死亡的人胎標本29例 (研究經(jīng)倫理委員會同意，每例標本的收集均經(jīng)產婦本人同意并簽署知情同意書)，根據(jù)測量其頂臀長，按Patten法［3］并結合其母體末次月經(jīng)日期推算胎齡，以每4周為一月齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下:第3個月齡(9～12周)組4例，第4個月齡 (13～16周)組4例，第5個月齡 (17～20周)組5例，第6個月齡(21～24周)組6例，第7個月齡 (25～28周)組4例，第8個月齡 (29～32周)組6例。

取材和切片(1)開顱，沿胎尸左側小腦半球同一部位垂直于小腦表面切取一組織塊，于10%的甲醛水溶液中固定24 h;(2)梯度酒精脫水; (3)二甲苯通明:二甲苯1、2分兩次各5 min的通明;(4)浸蠟:浸入70℃的蠟1 h;(5)包埋:用70℃蠟包埋，使包埋塊于室溫下自然冷卻凝固;(6)切片:用組織切片機進行切片，每片厚5 μm，切片裱于涂有0.5%明膠的載片上，并放入60℃烤箱內烤1 h。

免疫組織化學染色常規(guī)脫蠟至水，3%的H2O2蒸餾水溶液孵育10 min，滅活內源性過氧化酶，將切片入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液 (pH 6.0)加熱至沸騰后斷電，5 min后再重復1次，自然冷卻至室溫，抗原修復液孵育10 min，滴加正常山羊血清封閉液孵育30 min，傾去封閉液，滴加兔抗nNOS血清 (1∶100)，4℃過夜，滴加即用型生物素標記的二抗 (羊抗兔IgG抗血清)孵育20 min，滴加即用型鏈霉素親霉素酶復合物 (strept avidin-biotin complex，SABC)，孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidine，DAB)-H2O2染色液顯色，以上各步之間均用緩沖液浸洗3遍，每遍5 min。顯微鏡下控制顯色反應時間，磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)終止顯色，蒸餾水洗后，常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡觀察。

對照實驗用 PBS替代一抗、二抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。

結果判定和圖像分析切片經(jīng)染色后，NGF陽性神經(jīng)元的胞膜和胞質呈黃色或黃褐色，細胞核不著色。用 NISDR專業(yè)圖像處理分析軟件 (日本Nikon)測定某一視野下NGF陽性染色細胞的IA，每張切片隨機選取3個視野，對每份樣本4張切片的3個視野陽性染色細胞的IA值取平均值，組間比較采用單因素方差分析。

統(tǒng)計學處理用 SPSS 11.15統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析進行比較。

結 果

HE染色HE染色有助于辨認小腦皮質的組織結構，但不能辨認NGF陽性神經(jīng)元 (圖1)。

免疫組織化學觀察用PBS替代一抗、二抗進行的免疫組織化學對照實驗均未見NGF陽性神經(jīng)細胞 (圖2)。第3個月齡時，在小腦的室管層、中間層和邊緣層均可見NGF陽性反應神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體為圓形，大小不一，呈散在分布，神經(jīng)元的一端或兩端帶有突起，有的突起較長，小腦血管內皮細胞和單核巨嗜細胞都出現(xiàn)典型的NGF強陽性物質(圖3A)。第4個月齡時，室管層NGF陽性神經(jīng)元胞體呈圓形，胞質少，核漿比大于1，在神經(jīng)元的一端或兩端見突起，中間層可見NGF陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維分布，有的神經(jīng)元胞體比室管層神經(jīng)元胞體大，胞質相對增多，染色加深;邊緣層NGF陽性神經(jīng)元胞體較小，呈圓形或梭形，神經(jīng)突起明顯 (圖3B);外顆粒層未見NGF陽性神經(jīng)元。第5個月齡時，室管層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，胞體較小，呈圓形或橢圓形，胞質相對增多，突起伸長，蒲肯野細胞層呈NGF陽性表達，邊緣層可見NGF陽性神經(jīng)元胞體呈圓形或梭形，染色較深，有的神經(jīng)元突起較長，有的較短，有的神經(jīng)元有多個神經(jīng)突起 (圖3C)。第6、7個月齡時，蒲肯野細胞胞體增大，胞質增多，NGF染色加深，在神經(jīng)元之間形成較密集的神經(jīng)纖維網(wǎng)，邊緣層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量較多，胞體較小，呈圓形或橢圓形 (圖3D、3E);內顆粒層NGF陽性神經(jīng)元細胞數(shù)量和大小與第5個月齡相似;外顆粒層未見NGF陽性神經(jīng)元。第8個月齡時，蒲肯野細胞胞體呈圓形或梨形，每個蒲肯野細胞都向分子層伸出多個粗大突起纖維，NGF陽性反應較強;分子層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)量增多，胞體較小，呈圓形，染色較深;顆粒細胞層NGF陽性神經(jīng)元胞體較小，呈圓形，細胞質少，呈NGF陽性反應(圖3F)。

IA值結果第3～8個月齡段IA值逐漸升高，且每兩個月齡組IA值之間差異均有統(tǒng)計學意義 (P均＜0.05)(表1)，提示NGF在人胎小腦皮質神經(jīng)元的陽性表達呈現(xiàn)由少到多的規(guī)律。

圖1 第3個月齡人胚胎小腦皮質HE染色結果 (×400)Fig 1 HE staining results of cerebellar cortex of human fetus at the third month of gestation(×400)

圖2 人胚胎小腦皮質免疫組化染色陰性對照實驗結果 (×400)Fig 2 Negative control immunohistochemisty of experiment results of cerebellar cortex of human fetus(×400)

表1 NGF在不同胎齡小腦皮質神經(jīng)元表達的積分吸光度Table 1 Expression of NGF in the cerebellar cortical neurons of different gestational ages quantified by integral absorbance

討 論

胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生，起源于脊索背面外胚層增厚的神經(jīng)板，神經(jīng)板凹陷形成神經(jīng)溝，神經(jīng)溝兩側高起的神經(jīng)褶逐漸靠攏并聯(lián)合，形成神經(jīng)管，神經(jīng)管的頭端部分發(fā)育形成大腦、中腦、丘腦和小腦等。1970年Boulder神經(jīng)科學會建議把分化中的神經(jīng)管壁細胞分為4層:室管層、室管下層、中間層、邊緣層。小腦皮質的神經(jīng)元最初來源于室管層，室管層細胞經(jīng)過不斷分裂、增殖、遷移形成了中間層和邊緣層。小腦的組織發(fā)生有別于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他部分，因為在小腦表面有一個次級增殖區(qū)，這個次級增殖區(qū)即為外顆粒層。它是自神經(jīng)上皮層發(fā)生的一些細胞通過邊緣層遷移到小腦表面下方，這層細胞被認為是移位的神經(jīng)上皮細胞，仍保持分裂能力。胚胎第6個月齡時，自外顆粒層釋放出NGF陽性神經(jīng)細胞，向正在分化的蒲肯野細胞深層方向遷移，依次形成小腦的顆粒細胞、高爾基細胞和筐籃細胞［4］。

圖3 第3～8個胎齡人胚胎小腦皮質中NGF陽性神經(jīng)元細胞免疫組化染色結果 (SABC，×400)Fig 3 Immunohistochemisty of NGF-positive neurons in the ependymal layers of the cerebellum at the third to tenth month of gestation(SABC，×400)

NGF是一種蛋白類多肽，在生物體內廣泛分布，中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及唾液腺、前列腺等都可以合成并分泌，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促進神經(jīng)元突起生長雙重生物學功能［5-6］。本研究發(fā)現(xiàn)在胚胎第3個月齡時，小腦室管層、中間層和邊緣層均可見NGF陽性神經(jīng)元，形態(tài)特征是:胞體較小，胞質少，說明該月齡小腦內NGF活性較低，是NGF陽性神經(jīng)元分化形成的早期階段。并且在該月齡時可見小腦血管內皮細胞出現(xiàn)NGF陽性反應物質，提示NGF對血管內皮細胞的增殖及血管發(fā)生具有重要的意義。第4個月齡時，小腦初步分化為表面的皮質和中央的白質，胚胎早期的小腦皮質從表面向深部依次分為外顆粒層、邊緣層、中間層和室管層。中間層NGF陽性細胞是小腦皮質發(fā)育、增厚和分化、遷移的主要細胞。本研究觀察到，第4個月齡時，中間層NGF陽性神經(jīng)元胞體較大，胞質較多，神經(jīng)元之間出現(xiàn)NGF陽性神經(jīng)纖維，表明該月齡中間層NGF陽性神經(jīng)元合成和釋放NGF的能力增強，使得小腦中間層局部NGF濃度升高，可能高濃度的NGF對小腦各種細胞的增殖、分化、遷移、生長具有重要作用。有文獻報道，在胚胎發(fā)育期，NGF可誘導神經(jīng)纖維定向生長，刺激胞體和樹突的發(fā)育，促進神經(jīng)元的分化和纖維的延長［7-9］。本研究結果表明，第5～7月齡時，室管層和邊緣層NGF陽性神經(jīng)元數(shù)目迅速增多，同時蒲肯野細胞NGF陽性逐漸增強，胞體變大，突起增粗伸長。從HE染色切片上看，這一時期也是小腦皮質迅速增厚、各種細胞由內向外和或由外向內大遷移的時期，進一步表明NGF不僅對NGF陽性神經(jīng)元自身的生長發(fā)育，而且對小腦其他類型細胞的生長發(fā)育都具有重要作用。根據(jù)本研究的觀察，第8個月齡時，小腦皮質3層結構已初具雛形，蒲肯野細胞及其他類型的NGF陽性神經(jīng)元已基本發(fā)育成熟。

在胚胎第3～8個月齡時，IA值呈現(xiàn)逐月升高的趨勢，提示這6個月內NGF在人胎小腦皮質各層均有陽性表達，且由弱到強。結合形態(tài)學觀察，這些表明NGF不僅對該階段人胚胎小腦皮質神經(jīng)元和神經(jīng)纖維起到誘導發(fā)育生長的關鍵作用，對蒲肯野細胞等其他類型細胞的生長發(fā)育也有一定的重要作用。

總之，形態(tài)學觀察結果及IA值測量結果均表明，在人胚胎小腦皮質發(fā)育過程中，NGF在皮質中的表達呈由弱到強的變化規(guī)律，由此表明NGF在人胚胎小腦皮質的生長發(fā)育過程中起重要的作用。

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