核心蛋白聚糖對翼狀胬肉成纖維細胞增殖的影響*

周 清， 郭嫻吟， 楊筱曦， 陳 劍△

(1暨南大學附屬第一醫(yī)院眼科，廣東廣州510632;2東莞石龍人民醫(yī)院眼科，廣東東莞523320)

翼狀胬肉是一種常見的多發(fā)的眼表疾病，組織學以成纖維細胞異常增殖、膠原大量合成、細胞外基質過度沉積為組織學特點。國內(nèi)外諸多學者對其發(fā)病機制進行了深入的研究，但確切的發(fā)病機制目前尚未完全明了。目前明確其病因與太陽光紫外線(ultraviolet rays，UVR)照射有關，通過與之相關的自由基使大分子失活［1］。近10年來，通過分子遺傳學技術，對翼狀胬肉的發(fā)病機制研究收獲頗多［2］。藥物能在分子水平抑制血管生成及細胞增殖，進而抑制翼狀胬肉的生長是目前一個新的研究方向［3－4］。

轉化生長因子 β(transforming growth factorβ，TGF－β)在各種類型的纖維化疾病中的過度異常表達可能是引起組織纖維化的重要機制之一，被認為是目前最重要的致纖維化細胞因子之一。研究表明:在翼狀胬肉的上皮細胞，血管內(nèi)皮細胞及基底膜，成纖維細胞均有過量的TGF－β表達，體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細胞可被TGF－β促增殖［5］?；赥GF－β在翼狀胬肉的發(fā)生及反應進程中的重要作用，能特異性地抑制TGF－β生物學活性的物質成為本次研究的首選。而人核心蛋白聚糖(decorin，DCN)正是這樣一種物質，它作為一種已知的天然內(nèi)源性TGF－β阻斷劑而具有抗纖維化效果。從上世紀90年代初起，DCN在眼科領域也開展了相關研究，主要集中于角膜的研究［6］。目前，尚未對翼狀胬肉進行相關的研究，本實驗選擇體外培養(yǎng)的人翼狀胬肉成纖維細胞(human pterygium fibroblasts，HPF)作為研究對象，探討TGF－β抑制劑DCN對其增殖和凋亡的影響，并與傳統(tǒng)藥物絲裂霉素進行比較，為其用于翼狀胬肉的治療和術后預防復發(fā)提供前期實驗資料。

材料和方法

1 主要試劑

DCN(R＆D)，絲裂霉素 C(mitomycin C，MMC;華北制藥公司)，小鼠抗人角蛋白及波形蛋白單克隆抗體(Santa Cruz)，小鼠抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體(Santa Cruz)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

2 標本來源

共收集本院15例初發(fā)期翼狀胬肉患者的手術標本，其中男性9例，女性6例，年齡49～58歲。

3 主要方法

3．1 HPF的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 利用組織塊培養(yǎng)法采用含200 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細胞常規(guī)培養(yǎng)于溫箱中。待原代貼壁培養(yǎng)生長至基本匯滿培養(yǎng)瓶瓶底時用2．5 g/L的胰酶消化，按1∶2繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取第3或第4代細胞用于實驗。制備細胞爬片，SP法染色進行鑒定。

3．2 DCN及MMC對HPF增殖的影響 在傳代至第3或4代的HPF(貼壁24 h后)中加入DCN，并以MMC為對照，10 mg/L培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后在相差顯微鏡下觀察細胞分布及形態(tài)學變化。吸去上清，各孔加MTT 20μL，孵育4h，加120μL DMSO，振蕩后用酶標儀測490 nm處吸光度值(A)。實驗組細胞抑制率(inhibitory rate，IR)(%)=(陰性對照組平均A值－處理組平均A值)/陰性對照組平均A值×100%。

3．3 流式細胞術檢測DCN對細胞周期分布及凋亡情況 待HPF傳代至第3或第4代，取不同濃度的DCN(0．01、0．1、1、5、10 mg/L)分別處理 48 h 后的實驗組及對照組(不加藥)細胞懸液，每組各4瓶標本，PBS洗滌2次后離心，棄上清，加入70%冷乙醇，吹打成單細胞懸液后加入70%冷乙醇固定過夜，離心后棄上清，PBS洗滌2次，加入0．2 mg/L RNA酶50 mL，放入37℃恒溫箱30 min，碘化丙啶(PI)染色，4 h內(nèi)用FACS－420流式細胞儀(BD)檢測，選用488 nm激發(fā)波長測定樣本。

3．4 檢測DCN對細胞表達PCNA的影響 待HPF傳代至第3或第4代，將細胞懸液接種于鋪有蓋玻片(按細胞培養(yǎng)用品清洗和高壓滅菌)的6孔板中，孵育24 h后分為A、B 2組，A組為對照組，B組為DCN 組(0．01、0．1、1、5、10mg/L)，孵育 48 h 后取出蓋玻片，經(jīng)免疫組織化學SP法染色(同前)檢測PCNA的表達。結果分析采用比較PCNA標記指數(shù)(labeling index，LI)，即平均每100個細胞中的陽性細胞數(shù)。計算6個視野(放大倍率20×10)的全部陽性細胞及陰性細胞并列表，將計數(shù)資料進行χ2檢驗。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13．0軟件作統(tǒng)計處理，計量資料用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，組間差異性比較用單因素方差分析，細胞數(shù)量與吸光度值(A值)關系采用相關分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HPF免疫組織化學鑒定

體外培養(yǎng)的HPF經(jīng)SP法染色可見波形蛋白表達陽性，位于胞漿，呈現(xiàn)與成纖維細胞長軸方向一致棕黃色束狀或網(wǎng)狀結構;細胞角蛋白表達陰性，見圖1。

2 HPF生長曲線測定

對照組曲線可明顯區(qū)分為指數(shù)增長期(接種后2～6 d)和平臺期(6 d以后)，而用藥組曲線下移，上升緩慢，趨于低平，無明顯的指數(shù)增長期和平臺期，在用藥5～6 d吸光度達峰值，以后逐漸下降，見圖2。

3 不同濃度DCN及MMC對HPF的增殖抑制作用

Figure 1．Identification of human pterygium fibroblasts(immunocytochemical staining，×100)．A:positive expression of vimentin;B:negative expression of keratin．圖1 人翼狀胬肉成纖維細胞的鑒定

Figure 2．Growth curves of human pterygium fibroblasts from day 1 to day 8．ˉx±s．n=15．圖2 1～8 d人翼狀胬肉成纖維細胞的生長曲線

2組藥物隨濃度增加，其抑制作用增強，并呈劑量依賴性，見表1～3。DCN組不同濃度的抑制率均低于MMC組，尤其是當DCN藥物濃度低時，即＜1 mg/L，其抑制作用不明顯，當濃度＞1 mg/L時，其抑制作用增強增快。MMC組:隨時間的延長，細胞可出現(xiàn)毒性反應，可見細胞碎裂、崩解，有活性的細胞數(shù)逐漸減少。DCN組:藥物作用后隨時間的延長細胞數(shù)無明顯減少，無細胞碎裂、崩解，活性細胞形態(tài)無明顯改變，極少部分細胞貼壁性變差，形成團塊狀。

4 流式細胞術檢測不同濃度DCN對HPF細胞周期的影響

1～10 mg/L DCN使 G0/G1期細胞顯著增多(P＜0．05)，5～10 mg/L DCN使S期細胞下降顯著(P＜0．05)，沒有檢測到終末期凋亡細胞。增殖率G2/M%+S%反映了細胞增殖能力，5～10 mg/L DCN使 G2/M%+S%顯著下降(P＜0．05)，表明細胞增殖能力下降，見表4。

5 DCN對細胞PCNA表達的影響

細胞陽性表達顯示為棕黃色、黃色或淺黃色細小均勻顆粒，分布于整個細胞核;細胞核無著色、胞漿呈淡黃色者為陰性。1～10 mg/L DCN組的陽性細胞數(shù)較對照組差異非常顯著。PCNA標記指數(shù)隨著藥物濃度增加而遞減，說明DCN對HPF PCNA的表達有明顯影響并具有濃度依賴性，見表5。

表1 12 h不同濃度DCN及MMC對人翼狀胬肉成纖維細胞的抑制作用Table 1．The inhibitory effects of DCN and MMC on human pterygium fibroblasts treated for 12 h(ˉx±s．n=15)

表2 24 h不同濃度DCN及MMC對人翼狀胬肉成纖維細胞的抑制作用Table 2．The inhibitory effects of DCN and MMCon human pterygium fibroblasts treated for 24 h(ˉx±s．n=15)

表3 48 h不同濃度DCN及MMC對人翼狀胬肉成纖維細胞的抑制作用Table 3．The inhibitory effects of DCN and MMCon human pterygium fibroblasts treated for 48 h(ˉx±s．n=15)

表4 不同濃度DCN作用48 h對細胞周期時相的影響Table 4．Changes of cell cycle of human pterygium fibroblasts treated with DCN at different doses for 48 h(%．ˉx±s．n=15)

表5 不同濃度DCN作用48 h對細胞PCNA表達的影響Table 5．Changes of PCNA expression in human pterygium fibroblasts treated with DCN at different doses for 48 h

討 論

DCN作為TGF－β1的天然抑制劑，具有抗纖維化及抑制細胞生長的兩大特性，已被視為對器官纖維化及腫瘤具有良好治療前景的藥物。研究發(fā)現(xiàn)，DCN除了可干擾轉化生長因子TGF－β與其受體的結合而中和其活性從而具有減輕組織纖維化的作用外，還可修飾膠原蛋白鏈而調節(jié)膠原的合成，與纖連蛋白(FN)和血小板反應蛋白－1(TSP－1)結合從而起到抗黏附、抑制細胞與FN和TSP－1基質結合、調節(jié)細胞的增生、轉移和浸潤的作用。DCN單獨或與TSP－1結合能干擾細胞外基質(ECM)分子誘導的內(nèi)皮細胞受體的激活，從而阻斷細胞內(nèi)轉導通路引起的細胞骨架重構、遷移和管樣結構的形成［6］。另外，DCN還能與結締組織生長因子(CTGF)結合［7］，CTGF也是致纖維化因子之一。

DCN抑制包括腫瘤細胞在內(nèi)的細胞增殖，其機制可能是:(1)DCN能夠與TGF－βⅠ、Ⅱ、Ⅲ型受體競爭性結合TGF－β，DCN與TGF－β具有高親和力，DCN結合TGF－β成為無活性的復合物。一定劑量的DCN能使TGF－β1、TGF－β2和 TGF－β3活性降低，阻斷 TGF－β1、TGF－β2和 TGF－β3與相應的TGF－β受體結合。(2)DCN可以與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)互相作用，使其磷酸化，從而引起絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)的活化，導致細胞內(nèi)鈣離子動員和細胞周期素依賴性抑制物p21表達，最終導致細胞生長的抑制。p21是周期素依賴性蛋白激酶(CDK)強抑制因子，在不同組織來源的腫瘤細胞研究中也證實DCN抑制細胞生長是通過誘導p21表達［8］。(3)上調細胞內(nèi)的鈣離子濃度，可能激活蛋白激酶C信號通路。DCN可以上調細胞內(nèi)鈣離子濃度，并可被EGFR的特異性阻斷劑抑制，提示DCN與EGFR結合后通過上調細胞內(nèi)鈣離子濃度而激活蛋白激酶C信號途徑［9］。(4)DCN還可能通過抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮抗腫瘤作用。Grant等［9］研究證實，野生型腫瘤細胞的分泌物刺激血管內(nèi)皮細胞的黏附、遷移、分化及出芽過程，而DCN則可抑制這些過程;體內(nèi)實驗則表明，將表達DCN的腫瘤細胞種植于裸鼠體內(nèi)，腫瘤的生長及血管的生成速度明顯減慢，我們還證實DCN的此作用與其抑制腫瘤細胞VEGF的表達及分泌有關。

本實驗通過對體外培養(yǎng)的HPF進行觀察，發(fā)現(xiàn)第2～6代HPF細胞增殖旺盛，傳至第7代時，表明細胞開始向其它細胞類型發(fā)生轉變，為保證細胞活性的一致性，實驗均采用第3～4代 HPF，觀察10 mg/L DCN、MMC 分別在24 h、48 h、72 h 對翼狀胬肉成纖維細胞的影響發(fā)現(xiàn)，等濃度的2種藥物比較，DCN對細胞形態(tài)的改變遠遠低于MMC。

用流式細胞術分析細胞周期，1～10 mg/L DCN濃度 G0/G1期的細胞比率增高(P＜0．05)，5～10 mg/L DCN使S期的細胞下降(P＜0．05)，表明DCN可以延緩細胞由G1期向S期的過渡，提示DCN可能影響細胞周期，使HPF多數(shù)停滯于DNA合成前期，表明DCN可能抑制、干擾DNA合成，使細胞的倍增時間延長。沒有檢測到終末期凋亡細胞的結果表明DCN對HPF細胞增殖的抑制可能是使得細胞停滯在DNA合成前期，而并不影響細胞凋亡。G2/M%+S%反映了細胞增殖能力，5～10 mg/L DCN使G2/M%+S%顯著下降(P＜0．05)，表明細胞增殖能力下降。

PCNA是一種核內(nèi)蛋白，是DNA復制時 δ聚合酶的輔助物，其出現(xiàn)與細胞增殖有明顯關系，直接參與核內(nèi)DNA的合成，主要表達在細胞增殖周期的S期，被認為是一種準確、簡便、并且可直接了解細胞增殖狀況的研究指標。通過免疫組化方法對 PCNA表達的檢測，揭示 DCN可通過間接抑制 DNA復制而達到其抗增殖作用。經(jīng)DCN作用后，HPF中PCNA的表達下降，表明 HPF增殖減慢，生長受到抑制，與MTT和流式細胞術結果一致。

目前通過基因克隆技術也已成功獲得DCN［10］。從組織中提取天然DCN有廣泛的來源和技術上的可行性。鑒于DCN明顯抑制纖維化和強的抗腫瘤生長及轉移活性，加之其由人體產(chǎn)生、不具免疫原性、取材廣泛、可通過基因工程規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點，DCN被視為對器官纖維化及腫瘤具有良好治療前景的藥物。盡管如此，但目前尚存許多問題還沒有解決，如DCN對不同組織不同細胞，其作用不盡相同，濃度大小作用也不盡相同，國內(nèi)外有關DCN文獻報道其有效工作濃度基本上都是在 mg/L水平，0．01mg/L DCN可刺激正常肝細胞及肝星形細胞的增殖;5～10 mg/LDCN則具有抑制細胞生長的作用。而小劑量的DCN對肝癌細胞系HuH7即有明顯的抑制效果［11］。因此只有不斷探索，深入研究，才能對其應用前景得出肯定的結論。本文采用的是0．01～10mg/L范圍濃度，當DCN藥物濃度低時，即＜1mg/L，其抑制作用不明顯，當濃度＞1mg/L時，其抑制作用增強增快。

綜上所述，本研究從不同角度證實DCN具有很強的抗增殖作用，且在一定藥物終濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，提示 DCN有可能成為新型抗增殖藥物，并具有廣泛的來源和技術上的可行性。但尚須進一步研究和確認其抗增殖作用的機制。鑒于藥物作用在體內(nèi)外具有一定的差異，我們將進一步觀察和研究DCN對動物活體眼的藥效及毒性反應，以便確定有效治療濃度和最佳給藥途徑，為治療和預防翼狀胬肉的復發(fā)尋找新方法。

［1］ SaidT，DutotM，MartinC，etal．CytoprotectiveeffectagainstUV－inducedDNAdamageandoxidativestress:roleofnewbiologicalUVfilter［J］．EurJPharmSci，2007，30(3 －4):203 －210．

［2］ MarcovichAL，MoradY，SandbankJ，etal．Angiogenesis in pterygium:morphometric and immunohistochemical study［J］．CurrEyeRes，2002，25(1):17 －22．

［3］ BaharI，KaisermanI，McAllumP，etal．Subconjunctivalbevacizumabinjectionforcornealneovascularizationinrecurrentpterygium［J］．CurrEyeRes，2008，33(1):23 －28．

［4］ 陳毓東，王映芬，陳建蘇，等．半邊旗提取物5F誘導人翼狀胬肉成纖維細胞凋亡的研究［J］．中國病理生理雜志，2006，22(5):1024 －1027．

［5］ KottlerVB，JunemannAG，AignerT，etal．Comparative effectsofTGF－β1andTGF－β2onextracellularmatrix production，proliferation，andcollagencontractionofhuman Tenon'scapsulefibroblastsinpseudoexfoliationandprimaryopen － angleglaucoma［J］．ExpEyeRes，2005，80(1):121－134．

［6］ TufvessonE，Westergren－ThorssonG．Tumournecrosis factor－ α interactswithbiglycananddecorin［J］．FEBS Lett，2002，530(1－3):124－128．

［7］ GoldoniS，HumphriesA，NystromA，etal．Decorinisa novelantagonisticligandoftheMetreceptor［J］．CellBiol，2009，185(4):743 －754．

［8］ 馮秀艷，張志剛，趙仲華，等．飾膠蛋白聚糖對大鼠腎系膜細胞生長的抑制作用及其信號轉導途徑的研究［J］．中華腎臟病雜志，2005，21(9):512 －516．

［9］ GrantDS，YeniseyC，RoseRW，etal．Decorinsuppressestumorcell － mediatedangiogenesis［J］．Oncogene，2002，21(31):4765－4777．

［10］ BrownC，LinP，WalshM，etal．Extractionandpurificationofdecorinfromcornealstromaretainstructureand biologicalactivity［J］．ProteinExprPurif，2002，25(3):389－390．

［11］ IwafuneM，KakizakiI，YukawaM，etal．Reconstruction ofglycosaminoglycanchainsindecorin［J］．BiochemBiophysResCommun，2002，297(5):1167 －1172．