范智權(quán)，侯建軍，夏曉芬，梅芳芳，王元川，李杰東

（湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002）

五氯酚鈉為淡黃色或白色粉末，具有良好的水溶性，在自然界中降解緩慢，并可富集于底泥中，長期使用可造成環(huán)境污染和生物蓄積。其污染環(huán)境后，可通過食物鏈或其他途徑進入生物體內(nèi)，從而對人、畜等生物體造成毒害：大劑量PCP-Na進入生物體內(nèi)，可引起急性中毒甚至死亡；小劑量PCP-Na則具有潛在的遺傳毒性[1,2]。其作用機制主要是干擾生物代謝過程中的氧化磷酸化[3,4]。

環(huán)棱螺棲息于淤泥底質(zhì)的水體中，活動能力較弱，對污染避讓能力較差，水體環(huán)境質(zhì)量的好壞對其生長和繁殖有著重要影響。因此，環(huán)棱螺可作為水污染的指示生物[5]。環(huán)棱螺的上述生物標(biāo)志物能夠解釋污染物五氯酚鈉在水環(huán)境中對其進行毒性脅迫作用的機理，從而可用于評估水環(huán)境中污染物的生態(tài)風(fēng)險。本實驗以PCP-Na為目標(biāo)毒性物質(zhì)，用生物標(biāo)志物法來研究PCP-Na對環(huán)棱螺的毒理效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

環(huán)棱螺采自于湖北省黃石市磁湖，質(zhì)量2±0.2g，螺高16.77～21.70mm，螺寬11.75～13.03mm。實驗前選擇健康的環(huán)棱螺放在水箱中適應(yīng)和馴養(yǎng)一個星期。馴養(yǎng)期間，實驗用水為曝氣3d 的自來水，每日換水一次，其它飼養(yǎng)環(huán)境條件是：pH 6.4，飼養(yǎng)溫度16～25 ℃；急性毒理實驗前1天停止喂食，實驗期間不喂食[5]。

1.2 急性毒理實驗[6]

首先進行預(yù)實驗，使用不同濃度的五氯酚鈉溶液（濃度為0.1～1.6mg·L-1）在30cm×20cm×8cm的水箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為2L，每組放入環(huán)棱螺6只，遮光，觀察環(huán)棱螺的活動，記錄其死亡情況，以確定最大耐受濃度(LC0)和絕對致死濃度(LC100)。

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在急性毒理實驗時，設(shè)定濃度為0.1～0.8mg·L-1的7個梯度實驗組和一個空白對照。在水箱中加入實驗飼養(yǎng)水體積2L，每天更換全部實驗飼養(yǎng)水，每隔12h觀察記錄環(huán)棱螺的活動和存活情況，連續(xù)觀察96h，及時取出死亡個體，記錄環(huán)棱螺的藥物中毒情況及其死亡數(shù)量。采用寇氏(Korbor)法計算96h急性毒性實驗的半致死濃度LC50和其95%的置信區(qū)間以及安全濃度[7-9]。

1.3 毒性暴露實驗[10-12]

根據(jù)急性毒理實驗結(jié)果，得到五氯酚鈉的半致死質(zhì)量濃度為：0.411mg·L-1。參考國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的五氯酚鈉的濃度為0.01mg·L-1，設(shè)置五氯酚鈉的質(zhì)量濃度梯度為：0.00 mg·L-1，0.02 mg·L-1，0.04 mg·L-1，0.10 mg·L-1進行實驗。實驗生物的染毒方式采用靜態(tài)水質(zhì)法，水溫為16～25℃，pH6.4。在水箱中裝入2L的實驗用水，每一質(zhì)量濃度組放入環(huán)棱螺 120只。將環(huán)棱螺進行不同五氯酚鈉濃度梯度、不同時間的毒性暴露實驗。實驗期間，每天更換相同濃度的實驗用水一次，每隔 24h 隨機抽取12只環(huán)棱螺，置于冰盤中進行解剖，取其肝臟。用預(yù)冷的 PBS 緩沖液清洗，用濾紙吸干。

稱取環(huán)棱螺肝臟放入玻璃勻漿器中，加入20倍體積的預(yù)冷PBS緩沖液（pH7.2）研磨成勻漿（所有操作均在冰上進行）。4℃ 10 000g離心10min，取上清測定蛋白質(zhì)含量，并進行相關(guān)生物標(biāo)志物的測定[13]。GSH活性的測定采用DTNB法[14]。SOD活性的測定采用NBT法[15]。 酶活力單位定義為：每mg 組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達50 %時所對應(yīng)的SOD 量為1個活性單位(U) 。CAT活性的測定采用紫外吸收法[16]。酶活力單位定義為：以1min內(nèi)SOD240減少0.1的酶量為1個酶活單位（U）。丙二醛（MDA）的測定采用TBA法[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin8.0軟件繪圖。SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較（P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著）。

2 結(jié)果分析

2.1 環(huán)棱螺的中毒癥狀與死亡鑒定

環(huán)棱螺在接觸實驗用水后，高濃度組首先出現(xiàn)中毒癥狀。其中毒癥狀表現(xiàn)為：腹足回縮力量隨暴露時間的增加逐漸減弱，并伸出部分于殼外，伴有白色絮狀物質(zhì)溢到殼外；隨著暴露時間進一步延長，環(huán)棱螺對外界刺激反應(yīng)愈加遲緩直至死亡，腹足全部伸出殼外，腫脹泛白，對外界刺激再無反應(yīng)，最終內(nèi)臟與外殼脫離。

2.2 五氯酚鈉對環(huán)棱螺半致死濃度和安全濃度的計算

用 SPSS 軟件計算出 Na-PCP對環(huán)棱螺 96h的 LC50及其 95%置信區(qū)間分別是 0.411mg·L-1，(0.331～0.536mg·L-1)，用常規(guī)計算方法計算Na-PCP對環(huán)棱螺的安全濃度為0.0411mg·L-1。

圖1 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中GSH含量的影響

2.3 環(huán)棱螺各生物標(biāo)志物的變化規(guī)律分析

2.3.1 不同濃度五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中GSH含量的影響

如圖1所示，暴露24h時，0.04 mg·L-1和0.10 mg·L-1劑量組肝臟中GSH含量顯著增加（P＜0.01）。48h時，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組肝臟中GSH的含量有所上升，但 0.10 mg·L-1劑量組肝臟中GSH較24h時含量下降。72h時，0.02 mg·L-1劑量組肝臟中 GSH 含量顯著升高（P＜0.01），0.04 mg·L-1和0.10 mg·L-1劑量組肝臟中GSH含量降低。到96h時，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組含量依舊高于對照組（P＜0.01），但0.10 mg·L-1劑量組肝臟組GSH含量恢復(fù)到對照組水平。

2.3.2 不同濃度五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中SOD活性的影響

圖2顯示，在24h時，低劑量組（0.02mg·L-1）肝臟中的SOD活性顯著高于對照組（P＜0.05），而 0.04 mg·L-1和 0.10mg·L-1劑量組肝臟中的SOD活性均受到抑制。48h時，各劑量組肝臟中的SOD均受到顯著抑制（P＜0.01）。48h后，0.10 mg·L-1劑量組SOD活性持續(xù)增高，到96h時其活性顯著高于對照組；0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組肝臟中SOD活性先下降，到72h時，兩劑量組的酶活開始回升，到96h時活性達到對照組水平。

2.3.3 不同濃度五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中CAT活性的影響

圖2 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中SOD活性的影響

圖3 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中CAT活性的影響

根據(jù)圖3的結(jié)果，環(huán)棱螺肝臟在五氯酚鈉暴露的0～24h內(nèi)，CAT的活性均被誘導(dǎo)；但在24h后，各劑量組CAT活性均開始下降，48h時達到最低；從48h之后，各劑量組CAT活性開始升高，96h時明顯高于對照組（P＜0.01）。

圖4 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中MDA含量的影響

2.3.4 不同濃度的五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中MDA含量的影響

圖4表明，PCP-Na脅迫初期（0～24h）各劑量組肝臟中的MDA含量均顯著升高 (P＜0.05)。在24h 時，0.02mg·L-1和0.04mg·L-1劑量組肝臟中MDA含量達到最大值。24h之后MDA含量開始回落，0.10mg·L-1劑量組在24-48h內(nèi)，其MDA的含量仍繼續(xù)升高，在48h時達到最大值，此時含量明顯高于對照組（P＜0.01），隨后其含量逐漸下降，到 96h時，各劑量組肝臟中MDA的含量接近照組水平。

3 討論

3.1 五氯酚鈉暴露與環(huán)棱螺肝臟中GSH含量變化的關(guān)系

外源性化學(xué)物質(zhì)進入生物細(xì)胞后，會導(dǎo)致大量活性氧的產(chǎn)生，活性氧是高活性的分子，與生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用而對生理過程產(chǎn)生影響。GSH作為非酶類抗氧化物質(zhì)首先與外來化合物或自由基結(jié)合，保護細(xì)胞不受氧化損傷。當(dāng)細(xì)胞中GSH不足以清除外來物質(zhì)與自由基時，此時就會發(fā)生其他次級反應(yīng)，如脂質(zhì)過氧化或與細(xì)胞內(nèi)其他大分子發(fā)生共價結(jié)合[18]。本次實驗中，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組環(huán)棱螺肝臟中GSH含量隨著暴露時間的延長呈遞增的趨勢，原因可能是經(jīng)五氯酚鈉實驗水處理使得肝臟中自由基含量增加，在沒有超過GSH對毒性物質(zhì)的飽和誘導(dǎo)量時，GSH含量增加。而對于0.10 mg·L-1劑量組，環(huán)棱螺肝臟中GSH含量先上升后降低，GSH含量的降低可能與細(xì)胞對污染物及其代謝物解毒能力的飽和效應(yīng)有關(guān)，也可能是污染物長期毒性暴露效應(yīng)反應(yīng)的結(jié)果[11]。

3.2 五氯酚鈉啟動環(huán)棱螺肝臟中抗氧化酶系統(tǒng)的機制

目前，很多研究把超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等作為評價污染物對水生生物產(chǎn)生氧化脅迫的重要生物標(biāo)志物。它們的活性可由于污染物的脅迫而發(fā)生改變，從而可以間接地反映環(huán)境中污染物的存在，因而可作為污染物脅迫的有效指標(biāo)。用特定反應(yīng)中關(guān)鍵酶的變化來證實污染物的影響，可以指示污染物對生態(tài)系統(tǒng)所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，并能科學(xué)地評價污染物的環(huán)境風(fēng)險，從而具有重要的理論和實踐意義。SOD是使細(xì)胞免受氧化損傷的關(guān)健酶之一，能清除超氧自由基，催化使之轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，也與生物的抗污染脅迫密切相關(guān)。在暴露實驗過程中的初期，暴露時間短，且環(huán)棱螺體內(nèi)有非酶類抗氧化物質(zhì)如GSH的作用，此時SOD和CAT活性沒有顯著升高。然而隨著暴露時間的延長，SOD活性能夠被顯著誘導(dǎo)。本實驗中，48h之后，暴露在不同濃度的五氯酚鈉溶液中的環(huán)棱螺抗氧化系統(tǒng)啟動，隨著活性氧自由基的大量產(chǎn)生，SOD被誘導(dǎo)，活性不斷上升，從而導(dǎo)致 H2O2在細(xì)胞中含量升高。CAT作為H2O2濃度的調(diào)節(jié)器，活性升高，加速分解H2O2。在本實驗中，SOD和CAT的相關(guān)關(guān)系為：r=0.810，P＜0.01，這表明這兩種酶密切相關(guān)，并具有一定的協(xié)同性。這與張清順等研究銅對梨形環(huán)棱螺抗氧化酶活性影響中SOD和CAT的相關(guān)性的結(jié)果一致[11]。

SOD和CAT共同組成了生物體內(nèi)活性氧的防御系統(tǒng)，在清除超氧自由基、H2O2以及阻止或減少羥自由基形成等方面發(fā)揮了重要的作用。通常生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)處于一種平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個較低的水平，從而能有效地防止氧自由基的毒害，一旦這種動態(tài)平衡受到破壞，就可能產(chǎn)生傷害作用[7]。因此很多研究把CAT和SOD作為評價外源化合物產(chǎn)生氧化脅迫的重要生物標(biāo)志物。

3.3 五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟的脂質(zhì)過氧化作用

生物在逆境脅迫條件下，體內(nèi)自由基積累會導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)過氧化(lipid perxidation)的發(fā)生，從而降低了膜的流動性和選擇通過性，破壞了生物膜的功能。MDA作為生物脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，其含量常被用來評價生物的脂質(zhì)過氧化水平。在本次實驗中，在PCP-Na脅迫的前中期肝臟產(chǎn)生了大量的活性氧自由基，引發(fā)了脂質(zhì)過氧化，使得各劑量組肝臟中 MDA含量均明顯升高，脂質(zhì)過氧化損傷明顯。而在毒物的持續(xù)脅迫下，由于抗氧化酶系統(tǒng)的全面激活和GSH含量上升后產(chǎn)生的保護作用，使脂質(zhì)過氧化水平降低，MDA含量逐漸恢復(fù)到正常水平。

3.4 GSH、抗氧化酶及MDA的互動關(guān)系探討

外源有機化合物及其代謝產(chǎn)物可引起生物體內(nèi)活性氧自由基增加。為避免活性氧自由基引起蛋白氧化和脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞受損，最終造成生物體正常生理機能的破壞，生物激活其體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，誘發(fā)非酶類抗氧化物質(zhì)（如GSH）及抗氧化酶(如 SOD和CAT ) 的產(chǎn)生以清除機體內(nèi)過多的活性氧自由基[19]。在五氯酚鈉脅迫初期，GSH含量升高，清除外來化合物及活性中間體。當(dāng)GSH不足以清除外來物質(zhì)及自由基時，就可能啟動抗氧化酶系統(tǒng)。在本次實驗中，表現(xiàn)為脅迫初期GSH含量增加，較長時間（如48h）暴露后，SOD及CAT活性均被誘導(dǎo)增加。

機體抗氧化系統(tǒng)是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，由非酶和抗氧化酶組成的抗氧化系統(tǒng)在機體抵抗氧化脅迫和消除自由基損傷時起著重要作用，并且某些抗氧化成分之間還能相互影響。本實驗中，GSH、SOD、CAT及MDA圍繞自由基清除和對機體損傷這個功能核心，各自起著作用，彼此間又密切相關(guān)[20]。

環(huán)棱螺耐旱能力極強，移位距離很小，以其為實驗對象，采用生物標(biāo)志法研究五氯酚鈉的毒理效應(yīng)，能夠很好的反映五氯酚鈉對環(huán)棱螺的氧化損傷作用和環(huán)棱螺的防御作用機制，進而為探討持久性有機污染物對腹足動物的氧化損傷和防御作用機制提供基礎(chǔ)資料，同時也為污染物的生物監(jiān)測法提供更完善的資料。

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