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      Cx43/Cx45異型縫隙連接通道參與實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的實驗研究

      2012-11-17 07:15:24葉新運(yùn)
      關(guān)鍵詞:縫隙連接下腔腦血管

      葉新運(yùn), 洪 濤

      自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是常見而又嚴(yán)重的腦血管意外之一,腦血管痙攣(CVS)是SAH后的嚴(yán)重并發(fā)癥。目前臨床上針對CVS的預(yù)防及治療雖有一定效果,但仍不能令人滿意,所以在CVS的具體病理機(jī)制及相應(yīng)治療方面仍需深入研究,并成為當(dāng)今國內(nèi)外研究的熱門課題之一[1]。縫隙連接(Gap junction,GJ)是相鄰細(xì)胞間離子及小分子物質(zhì)交換的直接通道,是細(xì)胞間信息傳遞的重要途徑,允許離子、分子量小于1.2kDa、直徑小于10nm的物質(zhì)分子及一些第二信使通過,成為化學(xué)耦聯(lián)通道和代謝耦聯(lián)通道。通常情況下,很多細(xì)胞能表達(dá)多種Cx并形成至少包括兩種不同的Cx的異型縫隙連接通道,為機(jī)體提供了一種能很好地調(diào)節(jié)縫隙連接通訊的方法[2]。我們前期研究結(jié)果表明GJ在SAH后CVS中發(fā)揮著重要的作用[3,4]。甘珀酸(carbenoxolone,CBX)作為一種公認(rèn)特異性較強(qiáng)的GJ阻斷劑將應(yīng)用于本實驗。本實驗通過建立兔二次注血SAH模型,探討SAH后縫隙連接蛋白Cx43-Cx45組成異型縫隙連接通道的變化,進(jìn)一步探討SAH后GJ參與CVS的發(fā)病機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 材料 兔抗Cx43、Cx45多克隆一抗購自于Zymed公司(可用于免疫共沉淀);Preotein Agarose beads購自Santa Cruz公司,兔抗GAPDH一抗購自于Chemicon公司;甘泊酸(CBX)購自于Sigma公司,山羊抗兔二抗購自于Jackson公司;正常兔血清購自博士德公司,戊巴比妥、硝酸纖維素膜購于美國promega公司;照影劑 OMNIPAQUE(350mg/ml)為丹麥生產(chǎn);DAB顯影試劑盒購于北京中衫公司;WIP組織細(xì)胞裂解抽提試劑盒購自于北京賽馳生物科技有限公司,其余試劑為國產(chǎn)。新西蘭大白兔由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)研究部提供。

      1.2 體內(nèi)CVS模型的建立 采用兔的二次注血致蛛網(wǎng)膜下腔出血模型[5]。方法如下:24只體重2.5~3.5kg的雄性新西蘭大白兔被隨機(jī)分為3組;分組情況為正常對照組、SAH-7d組及SAH-7d+CBX組,每組n=12只。注血組動物3%戊巴比妥(20mg/kg),耳緣靜脈注射麻醉后,常規(guī)備皮消毒后,耳中動脈抽取自體血,穿刺枕大池,引出1ml腦脊液后注入0.5ml/kg自體動脈血;次日重復(fù)此操作。其中各組中4只用于腦血管造影,4只用于Cx43免疫共沉淀,4只用于Cx45免疫共沉淀。

      1.3 腦血管造影及血管直徑的測量 3%戊巴比妥(65mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉動物,保持其自主呼吸及心跳,然后取仰臥位。用軟紗布條將其四肢固定于造影床,右側(cè)腹股溝備皮并按無菌術(shù)要求消毒。于右側(cè)腹股溝下方切開皮膚及軟組織以暴露股動脈,帶芯導(dǎo)引鞘管插入股動脈,拔除鞘管芯后立即將5F導(dǎo)管經(jīng)鞘管插入股動脈,在透視下將導(dǎo)管送至主動脈弓,然后向左后上方轉(zhuǎn)動導(dǎo)管將其送至左側(cè)椎動脈入口。在相同放大率下注入OMNIPAQUE 2ml后行腦血管DSA造影?;讋用}的直徑應(yīng)用計算機(jī)影像分析系統(tǒng)(NIH Image version 1.62)進(jìn)行測量;每個基底動脈圖像取3個測量點(diǎn):兩側(cè)椎動脈匯合點(diǎn)上方0.1mm處,基底動脈中點(diǎn)以及基底動脈頂端下方0.1mm處;3點(diǎn)測量的平均值作為基底動脈的直徑值。

      1.4 免疫共沉淀 在冰上使用潔凈的工具用最快的速度切取待測的基底動脈,將組織放入圓底離心管中,浸入液氮以達(dá)到“snap freeze”后將組織冰浴,每5mg組織加入300μl WIP裂解液,使用勻漿器將組織勻漿,然后將組織液在4℃緩慢搖動3h,12000r/min 4℃離心20min。將上清吸出到新的預(yù)冷的離心管中(保持冰浴),棄沉淀 。取10~500μg細(xì)胞裂解物,加入Cx43/Cx45/正常兔血清10μl,4℃緩慢搖動孵育過夜,加入混勻的 100μl protein-Abeads,4℃緩慢搖動 4h,2500r/min(約 1000g)4℃離心5min,小心吸除上清,用裂解液洗滌沉淀3~5次,最后一次洗滌后,去除上清,加入250μl 4×SDS電泳上樣緩沖液,95~100℃煮沸5min,離心后取上清,棄沉淀。得到的上清分裝,-80℃保存。

      1.5 Western Blot檢測Cx43-Cx45在體內(nèi)的相互作用蛋白表達(dá)變化 取方法4提取的蛋白,測定蛋白濃度,按每泳道加總蛋白30μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉封閉后加入1:125稀釋的Cx43/Cx45多克隆抗體(Zymed公司)和GAPDH(Chemicon公司),4℃孵育過夜,洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育2h,用化學(xué)發(fā)光法在暗室中曝光,曝光后,顯影定影,GADPH作為內(nèi)參對照。蛋白條帶結(jié)果采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析,以條帶中正常對照組目的條帶和GADPH條帶灰度值之比作為Cx43與Cx45相互作用蛋白的相對含量。觀察腦血管痙攣后Cx43與Cx45相互作用的程度。

      1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,所有計量指標(biāo)數(shù)據(jù)以χ±s表示;采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理;P<0.05為差異有顯著性,P<0.01為差異有極顯著性。

      2 結(jié)果

      2.1 動物體內(nèi)CVS模型的建立 成功建立兔二次注血蛛網(wǎng)膜下腔出血模型(CVS模型)。正常組7d時二次造影與首次造影血管直徑百分比97.2% ±1.5%,SAH組7d時二次造影與首次造影血管直徑百分比 64.2% ±6.3%(P <0.01)),SAH組7d+CBX時二次造影與首次造影血管直徑百分比92.4% ±3.7%(P >0.05),與正常組比較無明顯差異(見圖1)。

      2.2 Cx43抗體免疫沉淀后檢測Cx45的變化

      各實驗組均有Cx45蛋白表達(dá),其中正常組為47.3% ±1.8%;SAH-7d 組為 82.5% ±5.4%(P <0.01),與正常組比較有顯著差異性;Cx45蛋白在SAH-7d+CBX組的表達(dá)為52.6% ±4.8%,與正常組比較無差異性。

      2.3 Cx45抗體免疫沉淀后檢測Cx43的變化

      各實驗組均有Cx43蛋白表達(dá),其中正常組為36.20% ±3.1%,在 SAH-7d組高表達(dá)為74.3% ±4.6%(P<0.01),與正常組比較具有顯著差異性;而SAH+7d+CBX組為40.3% ±3.5%,與正常組比較無明顯差異。

      圖1 不同實驗組行DSA造影,比較基底動脈直徑變化

      圖2 Cx43抗體免疫共沉淀檢測SAH前后Cx45的變化

      圖3 Cx45抗體免疫共沉淀檢測SAH前后Cx43的變化

      3 討論

      腦血管痙攣(cerebral vaso spasm,CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachno id hemo rrhage,SAH)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)生率高達(dá)30% ~90%,常引起嚴(yán)重局部腦組織缺血或遲發(fā)性缺血性腦損害,甚至導(dǎo)致腦梗死,成為致死和致殘的主要原因。近年來隨著研究的不斷深入,認(rèn)為CVS是多因素和多環(huán)節(jié)所致,已經(jīng)認(rèn)識到氧合血紅蛋白、炎癥反應(yīng)、縮血管物質(zhì)增多、離子通道紊亂、血管細(xì)胞增殖等在腦血管痙攣發(fā)病中起重要作用。

      縫隙連接(gap junction,GJ)是細(xì)胞間直接進(jìn)行物質(zhì)交流的唯一通道,無論在脊椎還是無脊椎動物都發(fā)揮著重要的作用。GJ由相鄰的兩個細(xì)胞各提供一個特殊的由蛋白質(zhì)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)-連接子(connexon)兩兩對接而形成,連接子可由單一連接蛋白組成稱同聚體連接子(homometic connexon),也可有幾種連接蛋白構(gòu)成異聚體連接子(heterometic connexon),由相同連接子組成的縫隙連接稱作同型縫隙連接(homotypic gap junction),即12個Cx亞單位均相同;而由異聚體連接子參與組成的縫隙連接稱作異型縫隙連接(heterotypic gap junction)。

      通過生物化學(xué)技術(shù)可以將Cx45和Cx43進(jìn)行免疫共沉淀,進(jìn)一步表明這些Cx在體內(nèi)存在非常密切的關(guān)系[6]。Jiang等[7]應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)首次通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)多種縫隙連接蛋白可組合成異型縫隙連接通道。我們應(yīng)用免疫共沉淀方法分析了Cx43/Cx45在腦血管痙攣模型中的體內(nèi)相互作用程度。本研究發(fā)現(xiàn)不僅抗Cx43抗體能將Cx45蛋白沉淀下來(見圖2),而且抗Cx45抗體同樣能將Cx43蛋白沉淀下來(見圖3),而使用免疫前血清的泳道則沒有檢測到任何條帶,這些結(jié)果表明 Cx43與Cx45在體內(nèi)發(fā)生了相互作用。所以我們推測Cx43與Cx45在體內(nèi)的相互作用促進(jìn)了異型縫隙連接通道的形成,而我們實驗發(fā)現(xiàn)在SAH-7d組較正常組Cx43與Cx45的相互作用程度有顯著差異性,即Cx43與Cx45的相互作用蛋白在SAH-7d組較正常組顯著增高(P<0.01),而當(dāng)應(yīng)用CBX時,SAH-7d組與正常組Cx43與Cx45的相互作用表達(dá)程度無顯著差異性,我們推測在單純SAH-7d組Cx43與Cx45形成的異型縫隙連接通道明顯多于正常組及CBX+SAH-7d組,即縫隙連接阻斷劑CBX能抑制這些蛋白表達(dá)的變化。本實驗還發(fā)現(xiàn)Cx43與Cx45形成的異型縫隙連接通道的多少與CVS程度相一致,并且縫隙連接阻斷劑CBX能緩解SAH后的CVS及抑制Cx43與Cx45的高表達(dá)。我們推測CBX可能是通過抑制Cx43與Cx45等蛋白的合成、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn),最終影響它們之間的相互作用而減少異型縫隙連接通道的形成從而起到緩解CVS的作用。

      在病理狀態(tài)下出現(xiàn)的GJ蛋白表達(dá)數(shù)量的改變、表達(dá)類型的改變、分布的改變及結(jié)構(gòu)異常稱為重構(gòu)(remodeling)[8]。GJ蛋白重構(gòu)現(xiàn)象已得到廣泛證實,在功能上可影響GJ的啟閉、傳導(dǎo)性和通透性,使細(xì)胞間的電、化學(xué)、代謝通道發(fā)生異常改變,引起傳導(dǎo)信息的“選擇性過濾”等,成為多種疾病發(fā)生的分子病理基礎(chǔ)。而異型縫隙連接通道的這些在數(shù)量及類型上的變化正是屬于縫隙連接重構(gòu)的范疇。Hayrapetyan等[9]研究發(fā)現(xiàn)在Cx43/Cx45或 Cx40/Cx45組成的異型通道中,它們的跨膜電壓(Vm)依賴性分別減少30%和50%。最近一篇報道顯示Cx45/Cx43-Cx43異型通道更進(jìn)一步降低了Cx43連接子的電壓門控作用,表明這些異型Cx45/Cx43連接子具有更低的電導(dǎo)率并且誘導(dǎo)其相對連接子Cx43較小的電壓降[10]。有研究表明異型通道的連接子電壓門控特性發(fā)生了改變,因為由Cx45-Cx43組成的異型通道,這些異型連接子對接后抑制了Cx43的門控作用[11];鐘國強(qiáng)等[12]在體外利用 Cx43 和 Cx45共同培養(yǎng)成單側(cè)異型GJ通道,其偶聯(lián)率取決于分子探針注射的方向,產(chǎn)生單向傳導(dǎo)阻滯和慢傳導(dǎo)的現(xiàn)象,可能與心律失常再折返的解剖學(xué)基礎(chǔ)相關(guān)。因此,我們認(rèn)為Cx43與Cx45形成的異型縫隙連接通道的多少與細(xì)胞間的信息交流密切相關(guān),特別是在細(xì)胞間跨電壓、化學(xué)門控機(jī)制及一些離子、小分子的通透性與選擇性上存在差異。

      在心血管系統(tǒng)中,血管內(nèi)皮細(xì)胞可以同時表達(dá)Cx37、Cx40和Cx43,其中Cx37表達(dá)量最高。完整的內(nèi)皮細(xì)胞是維持血管正常生理功能所必需的,而Cx43是維持內(nèi)皮連續(xù)性及完整性所必需的,在大動脈和血流穩(wěn)態(tài)被擾亂的區(qū)域Cx43的表達(dá)較高。血管平滑肌細(xì)胞可以協(xié)同表達(dá) Cx43、Cx40、Cx45和Cx37,其中Cx43表達(dá)量最高,其他3種連接蛋白的表達(dá)量依次遞減。不同類型的連接蛋白可以形成不同類型的連接子,不同類型的連接子可以形成不同類型的縫隙連接通道,而不同類型的縫隙連接在導(dǎo)率、通透性及門控通道等特性方面均有很大的差別,這樣就構(gòu)成了縫隙連接在結(jié)構(gòu)組成和功能方面的多樣性。

      綜上所述,我們推測在SAH模型中,Cx43和Cx45形成的異型縫隙連接改變了血管壁細(xì)胞間的信息傳輸,導(dǎo)致收縮因子的增加或舒張因子的減弱,最終參與CVS的形成。

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