金藝?guó)P 蔣靜涵 黃群聯(lián) 王 瑩 劉東華 (皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 400)

治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的主要手段之一是采用以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但不同個(gè)體對(duì)其敏感性差異較大，預(yù)后也不同。其中，DNA修復(fù)能力是影響療效的重要原因〔1〕。核苷酸切除修復(fù)途徑是鉑類藥物引起DNA損傷的主要修復(fù)途徑，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)和著色性干皮病基因D(XPD)在核苷酸切除修復(fù)中起著重要作用。本文采用DNA測(cè)序和限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)兩種方法檢測(cè)晚期NSCLC患者ERCC1和XPD基因型，研究不同基因型與NSCLC患者應(yīng)用含鉑方案化療后生存期之間的關(guān)系，探討ERCC1和XPD的單核苷酸多態(tài)性(SNP)是否可以作為預(yù)測(cè)鉑類藥物化療預(yù)后的指標(biāo)，為腫瘤的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 73例NSCLC患者選自2007年11月至2009年11月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院住院患者，均經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診。其中男59例，女14例;年齡24～82〔平均(52.7±18.9)〕歲，≤60歲22例，＞60歲51例;鱗狀細(xì)胞癌42例，腺癌29例，差分化癌2例;按1988年國(guó)際肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅲ期26例，Ⅳ期47例。患者均經(jīng)CT掃描具有可測(cè)量的腫瘤病灶，化療前檢測(cè)血常規(guī)、肝腎功能均正常，心電圖無(wú)明顯異常，卡氏功能狀況評(píng)分均＞60分。所有病例均于化療前抽取外周靜脈血2 ml，置于乙二胺四乙酸鈉(EDTA)抗凝管，凍存于 －20℃冰柜。

1.2 方法

1.2.1 化療方案及療效評(píng)價(jià) 所有患者化療前簽署化療知情同意書，接受以順鉑(cisplatin，DDP)為基礎(chǔ)的化療。具體方案：DDP/紫杉醇(15 例)、DDP/長(zhǎng)春瑞濱(11 例)、DDP/吉西他濱(34例)、DDP/多西紫杉醇(13例)。具體用法：DDP 30 mg/m2，第2 ～4 天;長(zhǎng)春瑞濱(Navelbine)25 mg/m2，第 1、8天;吉西他濱(Gemcitabine)1 000 mg/m2，第1、8 天;紫杉醇(paclitaxel)175 mg/m2，第1天(維持3 h);多西紫杉醇(docetaxel)60 mg/m2，第1天(維持1 h);均經(jīng)靜脈滴注。上述治療方案每3～4 w重復(fù)，均在2～3個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效。療效評(píng)價(jià)參照WHO實(shí)體瘤(1981年)標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)。以 CR +PR +SD為臨床獲益。

1.2.2 臨床評(píng)價(jià) 總生存期(OS)為最終評(píng)價(jià)指標(biāo)。OS為從確診日起至患者死亡(死于原發(fā)腫瘤或并發(fā)癥)的日期;在數(shù)據(jù)截止尚生存的患者，以末次隨訪時(shí)間作為截尾數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 DNA抽提擴(kuò)增 采用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿提取法抽提外周靜脈血DNA〔2〕。4℃保存?zhèn)溆?。引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR總反應(yīng)體積50 μl：模板 DNA 2 μl，Taq 酶 2.5 U，10 × buffer 5 μl，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L。上 游 及 下 游 引 物 各10 pmol/L，加ddH2O至總體積50 μl。反應(yīng)在PTC-150型熱循環(huán)儀(美國(guó)MJ公司)上進(jìn)行，98℃ 5 min蛋白變性后，加入Taq酶(TIANGEN公司產(chǎn)品)，進(jìn)入熱循環(huán)。ERCC1反應(yīng)條件為：94℃變性30 s;56℃退火30 s;72℃ 延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸4 min。XPD反應(yīng)條件為：94℃變性30 s;59℃退火30 s;72℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸4 min。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min(電壓100 V)，溴乙啶(EB)染色，紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，數(shù)碼相機(jī)攝片保存，PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR擴(kuò)增引物、退火溫度、PCR產(chǎn)物大小

1.2.4 基因分型

1.2.4.1 DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠純化試劑盒(Axygen公司產(chǎn)品)純化回收，30 μl純化后的 PCR產(chǎn)物連同其上游引物由南京金斯瑞生物科技有限公司采用雙脫氧法在ABI-3730XL測(cè)序儀上進(jìn)行單向測(cè)序。

1.2.4.2 PCR-RFLP法進(jìn)行基因型分析 取10 μl ERCC1 C118T的PCR純化產(chǎn)物與2 μl BsrDⅠ(New England BioLabs公司)65℃水浴消化4 h，8 μl XPD Lys751Gln的PCR純化產(chǎn)物與2 μl限制性核酸內(nèi)切酶Pst I(New England BioLabs公司)于37℃水浴消化3 h，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，80 V電泳40 min，EB染色確定各基因型。同時(shí)，為保證基因分型的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選10例(13.7%)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析、χ2檢驗(yàn)和Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1、XPD基因型與臨床特征的關(guān)系 患者性別、年齡、不同的組織學(xué)類型和臨床分期間ERCC1、XPD基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.2 測(cè)序結(jié)果與PCR-RFLP方法結(jié)果 ERCC1 C118T、XPD Lys751Gln DNA測(cè)序結(jié)果與PCR-RFLP法結(jié)果圖一致，且各等位基因符合Hardy-Weinberg平衡定律。見(jiàn)圖1～圖7。

圖1顯示在ERCC1 C118T多態(tài)性位點(diǎn)堿基C沒(méi)有發(fā)生突變，只有 C一個(gè)波峰;PCR-RFLP法顯示1個(gè)片段(199 bp)，為C/C基因型。圖2顯示ERCC1 C118T多態(tài)性位點(diǎn)已突變?yōu)閴A基T，只有 T一個(gè)波峰;PCR-RFLP法顯示2個(gè)片段(120和79 bp)，為T/T基因型。圖3顯示在ERCC1 C118T多態(tài)性位點(diǎn)有堿基 C和 T兩個(gè)波峰出現(xiàn);PCR-RFLP法顯示3個(gè)片段(199、120和 79 bp)為 C/T基因型。圖 4顯示在 XPD Lys751Gln多態(tài)性位點(diǎn)堿基A沒(méi)有突變，只有A一個(gè)波峰;PCR-RFLP法顯示2個(gè)片段(189、131 bp)，為A/A(Lys/Lys)基因型。圖5顯示在XPD Lys751Gln1多態(tài)性位點(diǎn)一處堿基A沒(méi)有突變，只有A一個(gè)波峰;另一處堿基A和 C兩個(gè)波峰出現(xiàn);PCR-RFLP法顯示4個(gè)片段(189、131、126和 63 bp)，為 A/C(Lys/Gln)基因型。本研究中未發(fā)現(xiàn)C/C(Gln/Gln)基因型。

表2 患者一般情況與ERCC1、XPD基因型的關(guān)系〔n(%)〕

2.3 ERCC1、XPD基因型分布 73例晚期 NSCLC ERCC1 C118T存在三種等位基因型，其基因頻率分別為：C/C型基因頻率53.4%(39/73)，C/T型基因頻率 38.4%(28/73)，T/T型基因頻率8.2%(6/73)。本研究只檢測(cè)到XPD Lys751Gln兩種等位基因型，其基因頻率分別為：A/A型83.6%(61/73)，A/C型16.4%(12/73)，未檢測(cè)到純合基因突變型C/C型。

2.4 ERCC1和XPD基因型與NSCLC患者臨床預(yù)后的關(guān)系隨訪截止時(shí)間為2011年9月，全部患者中位生存期為18個(gè)月。ERCC1 C118T CC型中位生存期〔(19.803±4.604)個(gè)月〕與CT型中位生存期〔(15.993±4.283)個(gè)月〕、TT型中位生存期〔(16.233±1.369)個(gè)月〕之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.855，P=0.000;(χ2=8.602，P=0.003);而 CT 型中位生存期與TT型中位生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.701，P=0.402)。XPD A/A型中位生存期、A/C型中位生存期〔(18.044±4.831)、(18.075±4.667)個(gè)月〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.034，P=0.854)。見(jiàn)圖 8，圖 9。

圖1 ERCC1 C118T C/C基因型測(cè)序

圖2 ERCC1 C118T T/T基因型測(cè)序

圖3 ERCC1 C118T C/T基因型測(cè)序

圖4 XPD密碼子751 A/A基因型測(cè)序

圖5 XPD密碼子Lys751Gln A/C基因型測(cè)序

圖6 ERCC1 C118T經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsrD I作用后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖7 XPD Lys751Gln經(jīng)限限制性內(nèi)切酶Pst I作用后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖8 ERCC1不同基因型的NSCLC患者總生存期生存曲線

圖9 XPD不同基因型的NSCLC患者總生存期生存曲線

3 討論

循證醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，NSCLC的化療以鉑類為基礎(chǔ)，含鉑方案優(yōu)于不含鉑方案〔3〕。已有研究表明各種以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合方案在有效率和生存期上均無(wú)顯著差異〔4〕，但患者對(duì)它們的敏感性差異顯著，預(yù)后也不同。藥理遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究表明，腫瘤基因的SNP及其分子表達(dá)水平與化療療效和毒性反應(yīng)密切相關(guān)。

ERCC1基因的表達(dá)產(chǎn)物與DNA修復(fù)酶缺乏互補(bǔ)基因F(XPF)形成緊密的ERCC1-XPF異二聚體，是特異性的核酸內(nèi)切酶，具有識(shí)別和切除 DNA 5'端的雙重作用〔5〕。ERCC1 C118T可發(fā)生核苷酸 C→T改變，雖然兩者編碼的都是天門冬氨酸(asparagine，Asn)，但C→T轉(zhuǎn)換可能與密碼子選擇減半、ERCC1 mRNA產(chǎn)物及隨后的蛋白翻譯降低有關(guān)，降低了DNA修復(fù)能力(DNA repair capacity，DRC)〔6〕。

本研究顯示，NSCLC患者外周血中ERCC1 C118T C/C型的總生存時(shí)間較C/T型、T/T型延長(zhǎng)，提示ERCC1 C118T C/C型的NSCLC患者接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療可能生存獲益。這個(gè)結(jié)果與Su等〔7〕研究結(jié)果一致。錢曉萍等〔8〕研究腫瘤石蠟組織中ERCC1 codon118 SNP與接受鉑類藥物化療NSCLC患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果顯示C/C基因型患者的中位生存時(shí)間為25.0個(gè)月，而C/T及T/T基因型患者的中位生存時(shí)間僅為10.5個(gè)月，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，認(rèn)為ERCC1 codon118基因SNP可作為判斷NSCLC患者鉑類藥物化療的預(yù)后指標(biāo)。而Zhou等〔9〕研究結(jié)果顯示攜帶ERCC1 C118T C/T型、T/T型患者的總生存期較C/C型明顯延長(zhǎng)(17.5個(gè)月、13.5個(gè)月)。究其原因，可能與病理分期以Ⅳ期為主有關(guān)，有必要加大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)ERCC1基因型與臨床預(yù)后的關(guān)系。

XPD基因產(chǎn)物具有ATP依賴的5'→3'DNA解旋酶活性。XPD蛋白是轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物Ⅱ型轉(zhuǎn)錄因子H(transcription factorⅡH，TFⅡH)的核心組分，并且參與核苷酸切除修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程〔10〕。XPD在DNA修復(fù)過(guò)程中通過(guò)NER途徑去除多種因素導(dǎo)致的DNA損傷(如：鉑-DNA加合物)來(lái)發(fā)揮作用。該基因第751密碼子A→C改變導(dǎo)致Lys→Gln氨基酸替代。Lys751Gln(A→C)為有義突變導(dǎo)致氨基酸改變，從而影響DNA修復(fù)途徑。本研究顯示XPD Lys751Gln A/A型的中位總生存時(shí)間與A/C型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陳君臣等〔11〕的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究證實(shí)ERCC1 C118T多態(tài)性與NSCLC患者鉑類藥物化療后的生存期有關(guān)，在一定程度上可作為鉑類藥物化療后生存期的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

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