初建青，王文艷，房經(jīng)貴*，張春華，張彥平，宋長年

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京210095;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇南京210014)

葡萄是世界性的主要水果，也是我國栽培的主要落葉果樹之一。施肥是葡萄生產(chǎn)中重要的農(nóng)事操作，葡萄施肥時(shí)間的選擇往往都是根據(jù)作物的生長情況或物候期，是一種經(jīng)驗(yàn)性的操作，難以做到指導(dǎo)當(dāng)年精確施肥的水平。這不僅沒有達(dá)到施肥的最佳效果，而且造成肥料的浪費(fèi)以及由此引起的環(huán)境污染。另外，由于不同年份環(huán)境與氣候等外界因素的差異，當(dāng)年的調(diào)查信息用于來年的田間管理也是不夠理想與科學(xué)的。傳統(tǒng)的理論已經(jīng)難以促進(jìn)施肥、灌溉等重要農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)生質(zhì)的提高。現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為人們利用基因信息指導(dǎo)施肥提供了可能，正如Boss等［1］早在2000年就預(yù)測在將來的20年里對(duì)葡萄基因以及基因功能的認(rèn)識(shí)將加快通過基因工程手段對(duì)葡萄結(jié)果能力、果實(shí)成熟期以及植株生長習(xí)性等進(jìn)行更有效調(diào)控時(shí)期的到來。葡萄全基因的測序更是為葡萄分子生物學(xué)的研究提供了重要條件［2－3］。

氮是葡萄重要的營養(yǎng)元素，氮素進(jìn)入植物體后的代謝是一個(gè)相當(dāng)重要的生理過程，它直接影響到作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。而硝酸鹽還原酶(Nitrate reductase，NR)，亞硝酸還原酶 (Nitrite reductase，NiR)，谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)，谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)和天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase，AS)等氮代謝關(guān)鍵酶在氮的同化過程中起著不可或缺的作用［4－7］，不同作物品種、同一種作物不同器官組織中有關(guān)酶的活性對(duì)于氮用量、施用時(shí)間等均呈現(xiàn)一定的反應(yīng)［5，8－10］。葉面施肥對(duì)葡萄產(chǎn)量、品質(zhì)及生理方面的作用已有諸多研究［11－14］，但尚無葡萄葉面噴肥對(duì)氮代謝循環(huán)關(guān)鍵酶基因表達(dá)影響的報(bào)道。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)與研究需要，本實(shí)驗(yàn)分離和克隆了氮代謝循環(huán)途徑中上述5個(gè)關(guān)鍵酶對(duì)應(yīng)基因(GS，GDH，AS，NR和NiR)的編碼序列，對(duì)他們進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，并利用半定量RT-PCR和熒光定量PCR法研究了葉面施氮對(duì)氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究葡萄氮代謝機(jī)制以及提高葡萄葉面施肥效果提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試材取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)基地，選用6年生藤稔葡萄(V.vinifera×V.labrusca Fujiminori)，樹勢良好，果園實(shí)施常規(guī)水平管理。在葡萄開花前期(5月14日)上午9時(shí)以尿素(山西豐喜華瑞煤化工有限公司生產(chǎn))作為葉面肥，設(shè)置對(duì)照(噴清水)、0.3%、0.5%、0.7%(質(zhì)量比)4個(gè)濃度處理，每個(gè)處理噴施5株，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。分別于處理后6、24、48 h采集葉片，幼葉采自15個(gè)節(jié)位長枝條上的第12、13節(jié)位，老葉采自15個(gè)節(jié)位長枝條上的第3、4節(jié)位，－40℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 質(zhì)粒、菌株和試劑 大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。亞細(xì)胞定位載體pJIT166－GFP由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。PowerScriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶購自Clontech公司，DNase酶Ⅰ、Ex Taq酶、pMD18－T simple載體、dNTP、DNA Marker、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ和XbaⅠ購自TaKaRa公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司，T4 DNA連接酶購自Promega公司，DNA回收試劑盒、DL 2000 Plus DNA Marker為北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)合成(表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同處理對(duì)葡萄品質(zhì)指標(biāo)的影響 于果實(shí)成熟后每株葡萄隨機(jī)取5個(gè)果穗測其平均單果重(g)和平均果實(shí)大小(cm2)。其中，平均果實(shí)大小(cm2)=縱經(jīng)×橫經(jīng)。

1.2.2 RNA的提取與純化 葡萄葉片總RNA的提取、消化參照張彥蘋［16］和 Chang［17］的方法。mRNA的純化采用Promega公司生產(chǎn)的PloyATtract?mRNA Isolation System IV試劑盒進(jìn)行。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 以mRNA為模板，引物P01反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，引物P02延伸加帽子，空氣加熱條件下42℃保溫1 h，75℃保溫10 min，冰上冷卻2 min后，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 基因ORF及3'末端的擴(kuò)增 根據(jù)不同物種間同源基因的核酸序列相對(duì)保守的特點(diǎn)，在Gen-Bank的核酸(nr/nt)數(shù)據(jù)庫中檢索擬南芥的GDH基因序列145358164，NR基因序列30681919，NiR基因序列30699283，GS基因序列186531753和AS基因序列145339205，并分別以以上序列為探針對(duì)葡萄屬EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索，得到多條與之高度同源的葡萄 EST序列;將獲得的 EST序列用DNAStar軟件進(jìn)行首尾拼接，獲得新的Contig;以獲得的 Contig反復(fù)對(duì)葡萄 EST公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索、拼接，盡可能獲得全長cDNA［18］。以cDNA為模板分別利用氮素代謝循環(huán)途徑中的5個(gè)關(guān)鍵酶基因GDH、NiR、NR、GS、AS的上游引物和下游引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得各基因的ORF區(qū)，反應(yīng)體系為 50 μL:cDNA 2 μL，10 pmol/μL 的引物各1 μL，10 × Ex Buffer 5 μL，2.5 mmol/L 的 dNTP Mixture 5 μL，Ex Taq 酶0.25 μL，用滅菌純水補(bǔ)足到50 μL。反應(yīng)參數(shù)為 94℃ 預(yù)變性 5min，94℃ 45 s、Tm 45 s、72℃1 min、35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目標(biāo)片段進(jìn)行TA克隆，由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成測序。

1.2.5 亞細(xì)胞定位分析 分別以表1中含酶切位點(diǎn)的引物(用Primer Premier 5設(shè)計(jì)能擴(kuò)增包含整個(gè)ORF，但去除終止密碼子)擴(kuò)增GDH、NiR、NR、GS、AS基因，并克隆提取質(zhì)粒，分別經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ、SalⅠ和 BamHⅠ、HindⅢ和 SalⅠ、HindⅢ和XbaⅠ、HindⅢ和XbaⅠ、HindⅢ和SalⅠ、HindⅢ和SalⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶連接到pJIT166－GFP載體，得到 GFP/基因融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入DH5α，PCR、酶切篩選陽性克隆，并對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證［19］。微粒子彈的制備和受體材料的轟擊方法參照已有研究報(bào)道［19－20］。轟擊后的洋蔥表皮細(xì)胞25℃暗培養(yǎng)24 h后制片，于激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2)下觀察細(xì)胞中的熒光。將轉(zhuǎn)化后的洋蔥表皮用20%蔗糖進(jìn)行質(zhì)壁分離處理后，再分別用藍(lán)光(395 nm)和紫外光激發(fā)成像，選用B(IF2490)激發(fā)濾光器，用PM230全自動(dòng)顯微照相裝置拍照［19］。

1.2.6 半定量RT-PCR 為明確葡萄葉面噴施尿素對(duì)5個(gè)基因的表達(dá)的影響，利用尿素處理后老葉和幼葉的cDNA作為PCR模板，以葡萄中的UBI基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行半定量RT-PCR，為確保半定量 RTPCR的特異性，引物設(shè)計(jì)在每個(gè)基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，目的基因的引物未跨內(nèi)含子(表1)。反應(yīng)條件為:94℃變性3 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，Tm 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共 28 個(gè)循環(huán)后，72℃終延伸5 min。UBI反應(yīng)程序條件與擴(kuò)增目的基因的條件相同。

1.2.7 熒光定量PCR 參照已有研究報(bào)道［18，21］，分別取2 μg RNA以P01和P02引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，葡萄看家基因UBI為內(nèi)參進(jìn)行定量PCR，目的基因的引物及片段大小見表1。應(yīng)用Bio-Rad My-IQ 2熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。RCR的反應(yīng)體系按SYBR GreenⅠ(TOYOBO)說明書進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 s預(yù)變性，然后以95℃ 變性10 s、Tm退火20 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及熔解曲線。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LinRegPCR和Excel軟件，進(jìn)行相對(duì)定量法分析［22］，通過比較在不同組織待測基因與UBI基因表達(dá)量的比值，直觀地顯示出待測基因相對(duì)含量的變化。

2 結(jié)果分析

2.1 葉面噴施不同濃度尿素對(duì)葡萄單粒重、單穗重、果實(shí)大小及葉片生長情況的影響

從表2看出，0.3%、0.5%、0.7%3種不同濃度尿素水平的處理均顯著提高了藤稔葡萄的單粒重，與對(duì)照相比，分別提高了49.50%、39.50%、24.70%，其中0.3%濃度尿素的處理對(duì)單粒重的影響最為明顯;0.3%、0.5%、0.7%3種不同濃度尿素水平的處理均對(duì)藤稔葡萄的果實(shí)大小有一定的效果，分別比對(duì)照提高了36.4%、27.9%、26.9%，0.3%濃度尿素的處理對(duì)果實(shí)大小的影響最為明顯;與對(duì)照相比，0.3%、0.5%、0.7%3種不同濃度尿素水平的處理對(duì)藤稔葡萄單穗重的影響均達(dá)到顯著水平，分別提高了 85.83、79.70、39.64 g，其中0.7%濃度尿素的處理效果最不明顯，說明中尿素水平有顯著增大單粒重、果實(shí)大小及單穗重的作用，濃度過高反而效果不顯著。

從圖1看出，三個(gè)處理的葉片呈現(xiàn)較深的綠色，說明葉面噴施尿素有葉片生長的作用。但是，0.7%尿素處理的葉片上出現(xiàn)枯黃葉緣和分布規(guī)律枯黃斑點(diǎn)，這可能是噴施尿素濃度偏高造成的葉面燒灼。

表2 葉面噴施尿素對(duì)葡萄單粒重、果實(shí)大小及單穗重的影響Table 2 Effect of foliar applied urea on fruit biology character of fruit of Tengren grape

2.2 相關(guān)基因ORF區(qū)的克隆

以cDNA為模板分別利用GDH、NiR、NR、GS、AS 5個(gè)基因的上游引物和下游引物(未跨內(nèi)含子見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得各基因的ORF，得到大小與預(yù)期目標(biāo)片段長度一致的相應(yīng)條帶(圖2)。切膠回收純化各個(gè)片段，以pMD18－T simple為載體對(duì)回收片段進(jìn)行克隆。在選擇培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)上挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定，獲得了陽性克隆。測序的結(jié)果表明，特異擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)際大小見表1，包含上下游引物序列，將所獲得序列在NCBI上登錄，登錄號(hào)見表1。

2.3 5個(gè)基因的亞細(xì)胞定位

細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成后需要被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器中，只有轉(zhuǎn)運(yùn)到正確的部位才能參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)［23］。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)所克隆的GDH、NiR、NR、GS、AS基因表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中發(fā)揮功能的具體部位，本研究對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析(圖3)。本試驗(yàn)在綠色熒光蛋白與基因的融合基因表達(dá)載體構(gòu)建完成后，對(duì)載體目標(biāo)區(qū)域的測序結(jié)果表明融合基因載體構(gòu)建正確［19］，之后利用基因槍法將綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中，獲得高效瞬時(shí)表達(dá)，綠色熒光蛋白在475 nm藍(lán)光激發(fā)下產(chǎn)生509 nm的綠色熒光。對(duì)照GFP蛋白無核定位功能，可經(jīng)過核孔復(fù)合物擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞核，從而在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中都可以觀察到清晰的GFP的綠色熒光信號(hào)(圖3F)。本研究將 GDH、NiR、NR、GS、AS基因插入到35S啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白基因之間形成GDH-GFP、NiR-GFP、NR-GFP、GSGFP、AS-GFP融合蛋白，其中GDH-GFP在線粒體內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光(圖3A)，NR-GFP在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光(圖3B)，AS-GFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光(圖3C)，而 NiR-GFP(圖3D)和 GS-GFP(圖3-E)在細(xì)胞內(nèi)未產(chǎn)生綠色熒光，這可能是由于NiR-GFP和GS-GFP未表達(dá)，也有可能NiR-GFP和GS-GFP具有在葉綠體內(nèi)表達(dá)的特點(diǎn)而無法在沒有葉綠體的洋蔥細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生信號(hào)，故檢測不到定位信息。

2.4 相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)分析

2.4.1 基因特異引物的PCR驗(yàn)證 為避免qRTPCR結(jié)果的假陽性的影響，本研究分別利用5個(gè)基因的上、下游引物(表1)分別對(duì)部分取樣時(shí)期來源底物cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆、測序得到與預(yù)期PCR產(chǎn)物相符，并且RNA提取和消化過程嚴(yán)格地消除了DNA污染，說明引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)模板質(zhì)量均符合半定量RT-PCR、熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)要求，不存在假陽性現(xiàn)象。

圖3 GDH、NR、AS、NiR、GS基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位Fig.3 Subcellular localization of GDH，NR，AS，NiR，GS-GFP fusion protein in onion epidermal cells

2.4.2 葉面噴施不同濃度尿素對(duì)葡萄硝酸還原酶基因表達(dá)的影響 硝酸還原酶(NR)是植物氮代謝的限速酶，其基因表達(dá)高低控制著整個(gè)同化過程，且反映了蛋白質(zhì)合成和氮代謝的活性。NR活性受到很多環(huán)境因子調(diào)節(jié)，如氮源、光、O2/CO2、pH和溫度，還有些內(nèi)在因素如代謝物和植物激素。結(jié)果表明，葡萄硝酸還原酶基因(NR)的表達(dá)水平隨著葉面噴施尿素濃度的不同而表現(xiàn)出明顯的差異，在同一時(shí)間段下，表達(dá)水平在0.3%和0.5%濃度的處理下顯著高于CK和0.7%濃度的處理(圖4)，說明中尿素濃度有利于NR的表達(dá)，而高尿素濃度不利于NR的表達(dá);葡萄老葉NR在0.5%濃度的處理下表達(dá)水平顯著，幼葉NR在0.3%濃度的處理下表達(dá)水平顯著，說明葡萄老葉以噴施0.5%濃度的尿素對(duì)NR的表達(dá)水平影響顯著，幼葉以噴施0.3%濃度的尿素對(duì)NR的表達(dá)水平影響顯著。在同一濃度尿素水平下，NR在不同時(shí)間段的表達(dá)水平差異不一致:葡萄老葉NR在處理后48 h的表達(dá)水平顯著高于6 h和24 h，幼葉NR在處理后6 h的表達(dá)水平顯著高于24 h和48 h，說明葡萄幼葉NR對(duì)葉面噴施尿素的響應(yīng)要早于老葉。在同一濃度尿素水平和同一時(shí)間段下，NR在葡萄幼葉中的表達(dá)水平顯著高于老葉，說明葉面噴施尿素以噴布到幼葉對(duì)NR的表達(dá)水平影響顯著。NR在葡萄葉片噴施尿素后直至48 h一直保持著比較高的表達(dá)水平，因此其可以作為葡萄葉片噴施尿素中后期的氮代謝信號(hào)途徑的標(biāo)記基因。

圖4 葉面噴施尿素對(duì)葡萄硝酸還原酶(NR)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding nitrate reductase(NR)in grape leaves

2.4.3 葉面噴施不同濃度尿素對(duì)葡萄亞硝酸還原酶基因表達(dá)的影響 葡萄亞硝酸還原酶(NiR)是硝酸鹽同化途徑中第二個(gè)發(fā)揮作用的酶，反應(yīng)涉及從降解的鐵氧還蛋白向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)移6個(gè)電子，使之形成銨。圖5看出，在同一時(shí)間段下，NiR的表達(dá)水平在0.3%和0.5%濃度的處理下顯著高于CK和0.7%濃度的處理;在同一濃度尿素水平和同一時(shí)間段下，葡萄幼葉NiR的表達(dá)水平顯著高于老葉;在同一濃度尿素水平下，NiR在不同時(shí)間段的表達(dá)水平差異不一致:葡萄老葉NiR在處理后24 h的表達(dá)水平顯著高于6 h和24 h，幼葉NiR在處理后6 h的表達(dá)水平顯著高于24 h和48 h。與NR表達(dá)水平相比(圖4)，NiR在各個(gè)濃度水平和各個(gè)時(shí)間段下的表達(dá)水平均低于NR，說明葡萄葉面噴施尿素后NiR對(duì)信號(hào)的響應(yīng)效果不如NR顯著，可能是由于NiR位于NR催化反應(yīng)的下游，對(duì)信號(hào)的響應(yīng)比較置后。

2.4.4 葉面噴施不同濃度尿素對(duì)葡萄谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)的影響 葡萄谷氨酰胺合成酶(GS)是處于氮代謝中心的多功能酶，催化無機(jī)氮轉(zhuǎn)變成有機(jī)氮的第一步反應(yīng)，其基因表達(dá)的高低可以反映氮素同化能力的強(qiáng)弱。圖6看出，在同一濃度尿素水平下，GS各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)水平在老葉和幼葉之間存在顯著差異，幼葉GS的表達(dá)水平明顯高于老葉;NR在不同時(shí)間段的表達(dá)水平差異亦不一致:葡萄老葉NR和幼葉NR均在處理后6 h的表達(dá)水平顯著高于24 h和48 h。在各個(gè)時(shí)間段下，GS的表達(dá)水平均在0.3%和0.5%濃度的處理下顯著高于CK和0.7%濃度的處理。葡萄葉片噴施尿素后6 h時(shí)GS的表達(dá)量上升明顯，其表達(dá)水平明顯要高于其他基因，因此GS基因可以作為葡萄葉片噴施尿素前期的氮代謝信號(hào)途徑的標(biāo)記基因。

2.4.5 葉面噴施不同濃度尿素對(duì)葡萄天冬酰胺合成酶基因表達(dá)的影響 Nakano等［24］通過Northern雜交分析表明天冬酰胺合成酶基因(AS)在同一水稻植株不同組織中的表達(dá)水平不同，在同一組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平也不同。圖7看出，在同一濃度尿素水平和同一時(shí)間段下，葡萄AS在幼葉中的表達(dá)水平明顯高于老葉，說明噴施尿素以噴布到幼葉對(duì)AS的表達(dá)影響顯著。在同一濃度尿素水平下，AS在不同時(shí)間段的表達(dá)水平差異不一致:葡萄老葉NR在處理后48 h的表達(dá)水平顯著高于6 h和24 h，幼葉NR在處理后6 h的表達(dá)水平顯著高于24 h和48 h。AS的表達(dá)水平隨著葉面噴施尿素濃度的不同而表現(xiàn)出明顯的差異，在同一時(shí)間段下，老葉AS表達(dá)水平趨勢為U0.3% ＞U0.5% ＞U0.7% ＞CK，幼葉AS表達(dá)水平趨勢為U0.5%＞U0.3%＞U0.7%＞CK，但幼葉AS在6h的表達(dá)水平CK＞0.7%，這可能由于不同采樣時(shí)間以及采樣時(shí)的光照、氣溫、濕度等環(huán)境因素的影響而導(dǎo)致的表達(dá)趨勢不一致。與GS表達(dá)水平相比(圖6)，AS在各個(gè)濃度水平和各個(gè)時(shí)間段下的表達(dá)水平均低于GS，說明葡萄葉面噴施尿素后AS對(duì)信號(hào)的響應(yīng)效果不如GS顯著，可能是由于AS位于GS催化反應(yīng)的下游，對(duì)信號(hào)的響應(yīng)比較滯后。

圖7 葉面噴施尿素對(duì)葡萄天冬酰胺合成酶(AS)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding asparagine synthetase(AS)in grape leaves

2.4.6 葉面噴施不同濃度尿素對(duì)葡萄谷氨酸脫氫酶基因表達(dá)的影響 谷氨酸脫氫酶(GDH)一般參與氨基酸降解的氧化脫氧作用，在植物生育期內(nèi)，GDH在氨的再同化中起重要作用，尤其是在果實(shí)發(fā)育后期對(duì)于催化形成谷氨酸具有重要作用。試驗(yàn)結(jié)果(圖8)表明，噴施尿素的濃度不同，基因的表達(dá)水平存在一定差異，在同一時(shí)間段下以0.3%和0.5%濃度的處理對(duì)谷氨酸脫氫酶基因(GDH)表達(dá)的影響更為明顯，說明葉面噴施中濃度尿素更能夠誘導(dǎo)氮代謝循環(huán)中的GDH發(fā)揮作用。GDH的表達(dá)水平在0.7%濃度的處理下不如0.3%和0.5%濃度的處理顯著，可能是由于濃度過高對(duì)葡萄生長造成不利的影響。通過比較噴施同一濃度尿素后同一時(shí)間段葡萄老葉和幼葉中GDH的表達(dá)水平看出，幼葉GDH的表達(dá)水平總體上比老葉中的大，說明葉面噴施尿素以噴布到幼葉或新稍對(duì)葡萄GDH的表達(dá)水平影響更大。GDH在不同時(shí)間段的表達(dá)水平差異不一致，葡萄老葉中GDH的表達(dá)水平在葉面噴施尿素后48 h達(dá)到最高，老葉中GDH的表達(dá)水平在葉面噴施尿素后6 h達(dá)到最高。

3 討論

圖8 葉面噴施尿素對(duì)葡萄谷氨酸脫氫酶(GDH)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding glutamate dehydrogenase(GDH)in grape leaves

氮是植物的重要成分，對(duì)植物生長有著重要的作用。特別是葉片氮含量與光合作用之間有著高度正相關(guān)關(guān)系［25－26］。有關(guān)氮肥施用量對(duì)植物生長及產(chǎn)量的影響已有許多報(bào)道［27－34］。本試驗(yàn)中葡萄葉片的顏色隨著葉面噴施尿素濃度的增加而呈增深的趨勢(圖1)，說明葡萄葉面噴施尿素有利于葉片生長。楊陽等［35］的研究成果表明，所有噴氮處理均有利于提高葡萄果實(shí)的單粒重。單一葉面肥或不同組合的葉面肥均顯著提高了葡萄的單穗重，使果粒明顯增大，最終提高了葡萄的產(chǎn)量，增產(chǎn)率高達(dá)12.75% ～24.57%［36］。葉面噴施尿素后，藤稔葡萄的單粒重和果實(shí)大小明顯高于對(duì)照(表2)，說明葉面噴施尿素有利于提高葡萄果實(shí)的單粒重和果實(shí)大小。

大量的研究顯示，由于半定量RT-PCR與熒光定量PCR兩者的基本原理的一致性，兩者的結(jié)果存在高度一致性［18，21］。本研究采用半定量 RT-PCR與熒光定量PCR方法對(duì)葡萄5個(gè)氮代謝相關(guān)重要基因表達(dá)特性的研究表明，兩者的結(jié)果一致性比較高，說明了所利用的RT-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定與可靠。本實(shí)驗(yàn)通過噴施尿素后老葉和幼葉的基因表達(dá)情況比較得出，幼葉中同一濃度各個(gè)時(shí)間段的基因變化總體上比老葉中的大，可能是吸收的尿素優(yōu)先分配到新梢和嫩葉等新生器官中，而向下僅有少量的運(yùn)輸，說明葉面噴施尿素以噴布到幼葉或新稍對(duì)基因表達(dá)的影響效果更佳，這與孫培琪［8］在櫻桃上的研究結(jié)果是一致的。噴施尿素后48 h時(shí)，幼葉中各個(gè)基因的表達(dá)水平明顯高于老葉，說明了幼葉中肥效的持續(xù)時(shí)間可能要長于老葉。本研究噴施不同濃度尿素后基因的表達(dá)量總體上比對(duì)照有明顯變化，其中0.3%和0.5%濃度處理的效果比0.7%濃度處理的效果顯著，說明葉面適量噴施尿素可以誘導(dǎo)氮代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶發(fā)揮作用，并對(duì)氮同化有顯著效果;而0.3%和0.5%濃度的尿素對(duì)藤稔葡萄單粒重、單穗重、果實(shí)大小以及葉片生長情況比0.7%濃度處理的效果顯著(表1)，顯然噴施不同濃度尿素后基因的響應(yīng)情況與果實(shí)的生長情況同步增長，說明了0.3%和0.5%濃度的尿素適宜于葡萄葉面噴施。

不同植物達(dá)到穩(wěn)定吸收速率的誘導(dǎo)時(shí)間不同。小麥的最大吸收能力是在誘導(dǎo)10 h后達(dá)到，而玉米6 h，大麥 12 ～24 h［37］，不同植物關(guān)閉這一誘導(dǎo)系統(tǒng)所需的時(shí)間也不相同。從圖4～圖8可以看出，本研究中通過半定量RT-PCR與熒光定量PCR檢測噴施尿素后葉片中基因的表達(dá)情況，6 h時(shí)5個(gè)基因的表達(dá)量均高于對(duì)照，說明葉片在噴施尿素后6 h時(shí)已經(jīng)開始活躍的氮同化代謝，氮素代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶已經(jīng)發(fā)揮作用，直至48 h時(shí)5個(gè)基因的表達(dá)量仍高于對(duì)照，說明此時(shí)相關(guān)代謝仍比較活躍，也說明了葉面噴施尿素的肥效至少可以持續(xù)48 h。而對(duì)于噴施尿素后各個(gè)基因在6、24和48 h的表達(dá)水平出現(xiàn)一定的不一致性，可能是由于光照、氣溫、濕度等環(huán)境因素影響了酶的活性以致表達(dá)量出現(xiàn)一定的非規(guī)律差異，但具體的原因還需進(jìn)一步研究。

胞質(zhì)中的尿素經(jīng)脲酶水解為氨，進(jìn)而在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下進(jìn)入氮同化途徑，而外源氮源如尿素也可以誘導(dǎo)另一條調(diào)控途徑促進(jìn)NR基因及NiR基因的轉(zhuǎn)錄水平提高［38－39］。從本實(shí)驗(yàn)的表達(dá)分析結(jié)果可知葉面噴施尿素后GS以及其下游基因AS和GDH的表達(dá)量均比對(duì)照有明顯增高。雖然GS的上游基因NR及NiR的表達(dá)量也有增高的趨勢，但它們的表達(dá)量在葉面噴施尿素后6 h低于GS、AS，說明葉面噴施尿素可能誘導(dǎo)了另一條調(diào)控途徑，從而促進(jìn)了NR及NiR的表達(dá)，但此調(diào)控途徑對(duì)信號(hào)的響應(yīng)效果不如在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下進(jìn)入氮同化的途徑明顯。NR、GS在各個(gè)階段的表達(dá)水平分別高于NiR、AS，說明葡萄葉面噴施尿素后NR、GS對(duì)信號(hào)的響應(yīng)效果分別比NiR、AS顯著，可能是因?yàn)榈x循環(huán)途徑中NR、GS分別位于NiR、AS催化反應(yīng)的上游，對(duì)信號(hào)的響應(yīng)比較早。

Wan等［40］的研究表明，AS1表達(dá)的水平可以作為大豆育種中篩選高(或低)蛋白質(zhì)含量種質(zhì)的一個(gè)標(biāo)記。氮代謝關(guān)鍵酶調(diào)控基因也具有信號(hào)途徑標(biāo)記基因的特點(diǎn)，對(duì)于分析不同植物氮代謝信號(hào)途徑具有重要幫助。本實(shí)驗(yàn)的表達(dá)分析結(jié)果看出，葡萄葉片噴施尿素后6 h時(shí)GS的表達(dá)量上升明顯，其表達(dá)水平明顯要高于其他基因，因此GS基因可以作為葡萄葉片噴施尿素前期的氮代謝信號(hào)途徑的標(biāo)記基因。許多研究表明，硝酸還原酶是高等植物氮素同化的限速酶［41］，也是一種誘導(dǎo)酶［42］，而 NR 基因在葡萄葉片噴施尿素后直至48 h一直保持著比較高的表達(dá)水平，與前人研究結(jié)果相一致［39］，因此其可以作為葡萄葉片噴施尿素中后期的氮代謝信號(hào)途徑的標(biāo)記基因。

4 結(jié)論

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，中尿素水平的葉面噴肥有顯著增大藤稔葡萄單粒重、果實(shí)大小及單穗重的作用，濃度過高反而效果不顯著。對(duì)葡萄5個(gè)氮代謝相關(guān)基因的亞細(xì)胞定位及表達(dá)情況的研究結(jié)果表明，GDH-GFP定位于線粒體，NR-GFP定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，AS-GFP定位于細(xì)胞質(zhì)，而 NiR-GFP和GS-GFP在細(xì)胞內(nèi)未產(chǎn)生綠色熒光。5個(gè)基因在葡萄幼葉中的表達(dá)水平顯著高于老葉;在不同時(shí)間段的表達(dá)水平差異不一致，但表達(dá)水平均高于對(duì)照，其中以0.3%和0.5%濃度處理的效果最明顯。噴施尿素后6 h，GS的表達(dá)量上升幅度明顯高于其它基因，而NR在噴施尿素后48 h內(nèi)一直保持著比較高的表達(dá)水平;NiR、AS表達(dá)量的變化趨勢分別與NR、GS相一致，并且NR＞NiR，GS＞AS。

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