廣西殼菜果遺傳多樣性的ISSR研究

彭繼慶，曹福祥 許若嫻

(中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410004)

殼菜果(MytilarialaosensisLecomte)，別名米老排、三角楓、山桐油、米顯靈、馬蹄荷、朔潘[1]，屬金縷梅科(Hamamelidaceae)殼菜果屬(Mytilaria)常綠闊葉樹種．天然林分布于廣東的封開、信陽(yáng)、陽(yáng)春，廣西西南部的十萬(wàn)大山、龍川、那坡、德保、靖西和云南南部，老撾和越南也有分布，垂直分布在廣東海拔250～1 000 m，廣西和云南在海拔1 100～1 800 m之間的山谷、丘陵的中下部和溝谷兩旁[2]，是優(yōu)良速生用材樹種．其樹干通直，枝條較細(xì)，材質(zhì)較好，色澤美觀，經(jīng)久耐用，適于制作家具、膠合板等，在水土保持、土壤改良、混交造林、生物防火等方面作用明顯[3-4]．殼菜果葉子肥大嫩綠，營(yíng)養(yǎng)成分含量較高，是一種很好的飼料資源[5]；所分泌的樹脂的化學(xué)成分主要是脂類物質(zhì)[6]，其種仁含油質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)36.8%，是重要的油脂資源[7]．目前對(duì)殼菜果的研究多集中在引種[8]、育苗造林[9]和材質(zhì)利用等方面[2-3]，而殼菜果種群遺傳多樣性方面的文章迄今未見報(bào)道．

ISSR(inter simple sequence repeat)即簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性，由Zietkiewiez等[10]在 PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的分子生物學(xué)技術(shù)，ISSR標(biāo)記技術(shù)與RAPD相比具有檢測(cè)位點(diǎn)多、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性更好等優(yōu)點(diǎn)[11]；與AFLP相比具有操作簡(jiǎn)單、技術(shù)性低、花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)，適合一般的實(shí)驗(yàn)室使用．因此ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已在生物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性檢測(cè)、基因定位及遺傳圖譜等方面得到廣泛應(yīng)用[12]．利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)殼菜果種群多樣性進(jìn)行研究有助于從DNA分子水平上揭示殼菜果種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平，了解殼菜果的生存狀況和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，了解殼菜果種群間的親緣關(guān)系，為殼菜果的合理開發(fā)和利用提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

殼菜果樣品分別采自廣西憑祥、廣西德保、廣西靖西、廣西那坡4個(gè)殼菜果天然分布區(qū)，采樣過(guò)程中要防止采到同一棵樹的后代；每一樣品為同一株的新鮮葉片，選取沒有病蟲害的比較干凈的葉片，用紗布擦洗干凈后放入自封袋中，加入一定量的硅膠，搖動(dòng)袋子使硅膠與葉子充分接觸．將樣品放入保溫箱中，加入冰袋帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫畼悠凡杉闆r見表1.

表1 殼菜果種群分布地的基本情況

1.2 殼菜果基因組DNA提取及檢測(cè)

殼菜果基因組DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組提取試劑盒進(jìn)行提取，具體操作按照植物基因組提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，僅對(duì)離心時(shí)間和裂解時(shí)間稍作修改．

所提取的基因組 DNA 用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，倒膠前加入EB，終濃度為0.5 mg/L；用核酸蛋白測(cè)定分析儀檢測(cè)DNA樣品純度和濃度，將所有樣品DNA濃度稀釋為 40 mg/L，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 引物的合成與篩選

ISSR引物是根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第九套ISSR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成．從中篩選出9條擴(kuò)增條帶較多、條帶清晰、重復(fù)性好的引物用于ISSR-PCR擴(kuò)增．

1.4 ISSR-PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè)

利用篩選出的9條引物對(duì)43個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ISSR-PCR擴(kuò)增體系為：在20 μL的反應(yīng)體系中，模板DNA為30 ng，Mg2+濃度為2.75 mmol/L，TaqDNA聚合酶為36.67 nkat，dNTPs濃度為0.20 mmol/L，引物濃度為0.6 μmol/L，10×PCR Buffer 2.0 μL，最后用滅菌好的ddH2O將體系補(bǔ)足．?dāng)U增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50～54 ℃(依據(jù)引物而定)退火45 s，72 ℃延伸90 s，36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存．?dāng)U增產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用200 bp DNA Ladder Marker(200～3 000 bp)作標(biāo)記，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上成像，拍照．

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

M:200 bp DNA Ladder圖1 引物UBC835對(duì)殼菜果的多態(tài)性擴(kuò)增

電泳圖譜中擴(kuò)增出的每一條帶代表引物的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，視為有效的分子標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性．根據(jù)電泳圖譜中擴(kuò)增條帶的有無(wú)及擴(kuò)增片段的大小，有條帶的記作“1”，否則記作“0”，建立0/1數(shù)據(jù)矩陣，通過(guò)Popgene32軟件計(jì)算殼菜果群落的多態(tài)性位點(diǎn)百分比(PPB)、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shanon多樣性指數(shù)(I)、種群總基因多樣性(Ht)、種群內(nèi)基因多樣性(Hs)、種群間遺傳分化指數(shù)(Gst)及Nei’s遺傳距離(D)．

2 結(jié)果與討論

2.1 廣西殼菜果種群的擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性

9條引物對(duì)4個(gè)種群的43份廣西殼菜果樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，9條引物均能擴(kuò)增出很好的圖譜，(圖1為引物UBC836對(duì)43份廣西殼菜果樣品進(jìn)行擴(kuò)增的圖譜)共擴(kuò)增出129條帶，平均每條引物擴(kuò)增出14.3條帶，其中105條帶是多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶占81.40%，說(shuō)明43個(gè)廣西殼菜果樣品的ISSR標(biāo)記存在較高的遺傳多樣性．引物UBC841擴(kuò)增出13條帶，有12條帶是多態(tài)性條帶，多態(tài)性最高為92.30%，引物UBC840擴(kuò)增的多態(tài)性條帶最少，多態(tài)性也最低，為61.54%(表2)．

表2 ISSR引物擴(kuò)增位點(diǎn)

2.2 廣西殼菜果自然種群的遺傳多樣性分析

4個(gè)廣西殼菜果自然種群43個(gè)樣品的遺傳多樣性分析表明(見表3)，殼菜果在物種水平上的多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)為81.40%，表明其擁有較高的遺傳多樣性．在種群水平上，廣西憑祥種群的最高，為69.77%；其次為廣西德保和廣西靖西的種群，同時(shí)為62.79%；廣西那坡種群的最低，為54.26%.利用Popgene32軟件分析表明4個(gè)種群總體水平上的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)為1.845 0；有效等位基因數(shù)(Ne)為1.511 9；Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.296 9；Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.440 4．對(duì)4個(gè)種群而言，Na的變化幅度為1.542 6～1.697 7；Ne的變化幅度為1.355 9～1.471 8；H的變化幅度為0.203 1～0.268 6；I的變化幅度為0.300 4～0.394 5，其變化趨勢(shì)與種群位點(diǎn)多態(tài)性一致．說(shuō)明廣西殼菜果自然種群具有豐富的遺傳多樣性，在這4個(gè)種群中，廣西憑祥種群適應(yīng)環(huán)境的能力最強(qiáng)，其次為廣西德保種群和廣西靖西種群，廣西那坡種群最弱．因此，廣西憑祥的遺傳基礎(chǔ)最好，在將來(lái)的引種試驗(yàn)中建議從廣西憑祥引種是比較合理的．

表3 殼菜果種群內(nèi)的遺傳多樣性

2.3 廣西殼菜果自然群落的遺傳分化研究

殼菜果種群總基因多樣性(Ht)為0.294 8,種群內(nèi)的基因多樣度(Hs)為0.243 0，種群間基因多樣性等于總基因多樣性減去種群內(nèi)的遺傳多樣性，即種群間的基因多樣性為0.051 8；在物種水平上有82.43%的遺傳變異存在于種群內(nèi)，而17.57%的遺傳變異存在于種群間．各個(gè)種群之間的基因分化系數(shù)Gst為0.175 8，說(shuō)明殼菜果自然種群間存在一定程度的遺傳分化，但分化程度比較低．殼菜果種群間的基因流(Nm)為2.344 7，大于1，證明種群間存在一定的基因流動(dòng)，足以抵制遺傳漂變的作用．

2.4 遺傳一致度與聚類分析

如表4所示，廣西殼菜果4個(gè)自然種群之間的Nei’s遺傳距離范圍在0.055 8～0.138 5之間.廣西德保和廣西靖西2個(gè)種群之間的遺傳距離最小，說(shuō)明它們之間的遺傳差異最小;而廣西那坡種群與廣西憑祥之間的遺傳距離最大，為0.138 5，表明廣西憑祥與廣西那坡之間存在的遺傳差異也最大；4個(gè)種群的遺傳一致度變化范圍在0.870 7～0.945 7之間，變化趨勢(shì)與4個(gè)種群之間的遺傳距離變化趨勢(shì)一致．

表4 4個(gè)殼菜果種群間的遺傳一致度和遺傳距離

圖2 4個(gè)殼菜果種群間遺傳距離的聚類分析

根據(jù)Nei’s(1978)的遺傳距離對(duì)廣西殼菜果種群進(jìn)行UPGMA聚類分析(見圖2)，聚類結(jié)果表明：4個(gè)廣西殼菜果自然種群聚為兩大類，一類是廣西德保和廣西靖西的2個(gè)種群聚在一起，再與廣西憑祥的聚在一起；廣西那坡種群?jiǎn)为?dú)聚為一類．表明廣西德保與廣西靖西2個(gè)自然種群之間的親緣關(guān)系最近，與廣西那坡之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)．

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的基本特性，是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，遺傳多樣性的高低對(duì)種群的生存和分布有很大影響[13]．通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)殼菜果遺傳多樣性進(jìn)行分析，多態(tài)位點(diǎn)百分率為81.40%，比廣布型植物略低，如木荷的多態(tài)位點(diǎn)百分率為90.02%[14]，油松的多態(tài)位點(diǎn)百分率為91.67%[15]，楓香的多態(tài)位點(diǎn)百分率為87.41%[16]，比頻危植物要高，如資源冷杉的多態(tài)位點(diǎn)百分率為77.78%[17]．表明盡管殼菜果的多態(tài)位點(diǎn)百分率比廣布型植物要低，但殼菜果仍處于較高水平，仍有很強(qiáng)的適應(yīng)能力．廣西殼菜果的多態(tài)位點(diǎn)百分率介于廣布型植物和頻危植物之間，可能與兩方面原因有關(guān)：一是與廣西殼菜果自然群落的分布狀況有關(guān)，目前廣西殼菜果除了在廣西憑祥有大面積的天然林外，在廣西其他地方很少有成片的天然林，且多集中在一些林場(chǎng)或者在一些自然保護(hù)區(qū)，地理距離比較遠(yuǎn)，因此殼菜果的多態(tài)位點(diǎn)百分率比廣布型的要低；另一方面是殼菜果結(jié)實(shí)量大，種子的含油量高達(dá)36.8%[7]，種子的萌發(fā)能力比較強(qiáng)，發(fā)芽率在90%左右，易于植株的存活，這與Hamrick[18]提出的具有高水平遺傳變異的物種壽命長(zhǎng)、結(jié)實(shí)性高的觀點(diǎn)一致．

廣西殼菜果自然群落的遺傳分化程度比較低，種群內(nèi)的遺傳變異占主導(dǎo)地位，種群間遺傳變異小，這是由基因流和微環(huán)境共同作用的.基因流被視為是使種群遺傳結(jié)構(gòu)均質(zhì)化的主要因素之一, 具有廣泛基因流的物種遺傳分化程度也比較小[19]．殼菜果種群間的基因流(Nm)為2.344 7，說(shuō)明基因流發(fā)揮了均質(zhì)化作用．種群間微生境的差異也是產(chǎn)生種群間遺傳分化的原因之一，不同的微生境條件下存在不同的適應(yīng)型，種群的基因型之間必存在相應(yīng)的差異，從而產(chǎn)生種群間的遺傳分化[20]．本研究中的殼菜果樣品均來(lái)自廣西,溫度、水分、光照、土壤等生態(tài)因子變化較小, 微生境差異不大,不同種群所承受的生境選擇壓力差異比較?。悄壳昂芏鄰V西殼菜果天然種群都被分割開來(lái)，種群之間相距比較遠(yuǎn)，產(chǎn)生了生境片段化，而生境片段化可以阻斷原種群之間的基因交流[21]，降低遺傳多樣性，加大遺傳分化程度，估計(jì)隨著時(shí)間的推移，各種群之間的遺傳分化將逐漸增大．

本文從分子水平對(duì)殼菜果遺傳多樣性的研究，有助于了解其遺傳基礎(chǔ)，為種群保護(hù)、引種栽培和生產(chǎn)實(shí)踐提供參考依據(jù)；UPGMA聚類分析結(jié)果有助于探清殼菜果種群間的演化規(guī)律．但目前僅僅對(duì)廣西殼菜果天然種群進(jìn)行了研究，其他省份的殼菜果的生長(zhǎng)狀況和親緣關(guān)系還不清楚.下一步將在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)殼菜果進(jìn)行研究，除探清殼菜果天然種群間的親緣關(guān)系外，還要探清天然林與引種地之間的差異，從分子水平上了解殼菜果是怎樣對(duì)遷移地進(jìn)行適應(yīng)的，對(duì)引種是否成功從分子水平上作出評(píng)價(jià)．

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社，1979:50-52.

[2] 梁善慶,羅建舉.人工林米老排木材化學(xué)成分及其在樹干高度上的變異[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào),2004,24(5):28-31，52.

[3] 梁善慶,羅建舉.人工林米老排木材的物理力學(xué)性質(zhì)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27(5): 97-100,116.

[4] 鄭萬(wàn)鈞.中國(guó)樹木志(第二冊(cè))[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1985.

[5] 景躍波,楊德軍,馬賽宇,等.熱帶速生樹種米老排的育苗與造林[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù),2008(1):21-23.

[6] 黃秦康.常用中藥成分與藥理手冊(cè)[M].北京:中國(guó)醫(yī)學(xué)科技出版社,1994:18.

[7] 中國(guó)油脂植物編寫委員會(huì).中國(guó)油脂植物[M].北京:科學(xué)出版社,1987:346-347.

[8] 李良昌,廖翠蘭,黃德林,等.米老排在樂昌林場(chǎng)的引種及生長(zhǎng)表現(xiàn)[J].廣東林業(yè)科技,2003,19(4):66-68.

[9] 唐社云.米老排與南酸棗混交造林試驗(yàn)報(bào)告[J].西部林業(yè)科學(xué)，1992(2):35-40.

[10] ZIETKIEWIEZ E, RAFALSKI A, LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics, 1994, 20: 176-183.

[11] GILBERT J E, LEWIS R V, WILKINSONM J,etal. Developing an appropriate strategy to assess genetic variability in plant germ plasm collections[J]. Theor Appl Genet, 1999,6(98):1125-1131.

[12] 魏小玲,曹福祥,陳 建.海南木蓮基因組DNA提取及ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(5):91-96.

[13] 錢迎倩,馬克平. 生物多樣性研究的原理和方法[M]. 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社, 1994: 123-140.

[14] 金則新, 李鈞敏, 李建輝. 木荷種群遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2007, 33(3): 271-276.

[15] 李 毳, 柴寶峰, 王孟本. 華北地區(qū)油松種群遺傳多樣性分析[J]. 植物研究, 2006, 26(1): 98-102.

[16] 畢泉鑫,金則新,李鈞敏,等. 楓香自然種群遺傳多樣性的ISSR分析[J].植物研究,2010,30(1):120-125.

[17] 張玉榮,羅菊春,喻錦秀. 資源冷杉遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,29(6):41-46.

[18] HAMRICK J L, MITTON J B, LINHART Y B. Leves of genetic variation in trees: The influence of life history characteristics[C]//PACIFIC S W. Proc Symp on Isozymes of North American Forest Trees and Forest Insects. For Range Expt Stat Tech Report PSW-48,1981: 35-41.

[19] HAMRICK J L, LINHART Y B, MITTON J B. Relationships between life history characteristics and electropho retically detectable genetic variation in plants[J]. Annu Rev Ecol Syst,1979, 10:173-200.

[20] 陳小勇, 宋永昌. 安徽黃山西部青岡種群小地理范圍的遺傳分化[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 1998, 7(1): 10-14.

[21] 陳小勇. 生境片斷化對(duì)植物種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響及植物遺傳多樣性保護(hù)[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào),2000,20(5):884-892.