金屬鹽離子對苦蕎萌發(fā)及其總黃酮含量的影響

李曉丹 王 莉 王 韌 陳正行

金屬鹽離子對苦蕎萌發(fā)及其總黃酮含量的影響

李曉丹 王 莉 王 韌 陳正行

(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué)，無錫 214122)

研究了在一定濃度的鋁、鋅、銅鹽溶液浸種后，苦蕎種子萌發(fā)7 d內(nèi)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、粗蛋白含量的變化，并采用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)，用吸光光度法測定樣品中的總黃酮含量。結(jié)果表明，鋁、鋅、銅鹽溶液浸種萌發(fā)對種子的芽苗生長和粗蛋白含量增加有促進(jìn)的作用，而對發(fā)芽勢和發(fā)芽率影響并不顯著;正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對總黃酮含量影響因素顯著性依次為萌發(fā)溫度＞萌發(fā)時(shí)間＞金屬鹽種類，最佳萌發(fā)工藝條件為:金屬鹽種類為1 000 mg/L硫酸鋁溶液，萌發(fā)時(shí)間為84 h，萌發(fā)溫度25℃，在此工藝條件下，苦蕎種子中總黃酮含量可以達(dá)到1 347．1 mg/100 g DW。

苦蕎 萌發(fā) 粗蛋白 總黃酮含量

蕎麥隸屬蓼科(Polygonaceae)，蕎麥屬(Fagopyrum Mill．)，為非禾本科谷物，主要的栽培品種有2種，即甜蕎麥(F．Esculentum Moench，普通蕎麥)和苦蕎麥［F．Tataricum(L．)Gaertn，韃靼蕎麥］［1］。

苦蕎是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的雜糧，其中蛋白質(zhì)、脂肪含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大米、小麥;另外，在保健功能方面，苦蕎中富含多種微生物、礦物質(zhì)和膳食纖維，特別是含有豐富的生物類黃酮物質(zhì)［2］?？嗍w中的黃酮主要成分為蘆丁(槲皮素－3－O－蕓香糖苷)、槲皮素、山奈酚和桑色索等黃酮醇［3］。蘆丁(Rutin)是苦蕎含量最高的黃酮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)1．08%～6．6%，是甜蕎麥的9～300倍，占總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的70%～85%，在降血壓、降血糖、抗腫瘤和提高免疫力等方面具有相當(dāng)重要的作用［4－5］。我國苦蕎麥遺傳多樣性極為豐富，主要分為黃苦蕎和黑苦蕎，黃苦蕎即普通苦蕎，而黑苦蕎外殼呈黑色，種植面積小，蘆丁含量是黃苦蕎的3～5倍，其營養(yǎng)價(jià)值要比黃苦蕎高得多［6］。

谷物、豆類等經(jīng)適當(dāng)?shù)陌l(fā)芽處理后，其化學(xué)成分均有所改變，營養(yǎng)價(jià)值得以提高并且形成獨(dú)特的風(fēng)味及口感。近年來研究發(fā)現(xiàn)苦蕎及其芽苗中富含抗氧化的黃酮類物質(zhì)和手性肌醇單體，將其作為一種新型的食物原料和蔬菜備受消費(fèi)者青睞。種子在浸泡過程中使用適量濃度的鹽液浸種，使植物機(jī)體產(chǎn)生抗逆性反應(yīng)，在萌發(fā)中產(chǎn)生更多功能性物質(zhì)［7－8］。近年來有研究表明，蕎麥種子萌發(fā)后可使其蛋白質(zhì)的組成有所改變［9－10］，消化率顯著改善［11－12］;在鋁浸種后，種子在萌發(fā)的過程中通過提高細(xì)胞內(nèi)的POD和CAT活性、增加蛋白質(zhì)和可溶性糖含量、提高黃酮類化合物的含量及其活性來提高蕎麥的鋁適應(yīng)性［13－14］;通過在營養(yǎng)液中添加一些種子生長的必須微量元素，可使得芽苗產(chǎn)量顯著增加，而這些芽苗中富集的微量元素亦對人體有益［15－16］。

因此，本試驗(yàn)研究了在一定萌發(fā)時(shí)間和溫度下，用不同的金屬鹽溶液浸種后，黑苦蕎種子的發(fā)芽率和芽長以及萌發(fā)的黑苦蕎中粗蛋白和總黃酮含量的變化，以期為獲得富含黃酮類物質(zhì)的苦蕎種子及芽苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與設(shè)備

黑豐1號(hào):內(nèi)蒙;次氯酸鈉(CP)、硫酸鋁、硫酸銅、硫酸鋅、六水氯化鋁、乙酸鉀、乙醇、甲醇、濃硫酸、氫氧化鈉:均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;溴甲酚綠－亞甲基紅指示劑(3∶2)、蕓香苷:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV－1800型紫外可見分光光度計(jì):上海美譜達(dá)(MAPADA)儀器有限公司;LRH－150生化培養(yǎng)箱:上海恒科學(xué)儀器有限公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 苦蕎種子萌發(fā)試驗(yàn)

苦蕎種子經(jīng)除雜后，用5%次氯酸鈉浸泡30 min［17］，用去離子水沖洗干凈。用一定濃度的鹽液浸泡6 h［18］，浸泡溫度與后萌發(fā)溫度一致。雙層去離子水濕潤紗布鋪于萌發(fā)容器內(nèi)，將苦蕎種子均勻的攤開，蓋單層去離子水濕潤紗布，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定時(shí)收取萌發(fā)的苦蕎種子50℃烘箱干燥，磨粉，過60目篩，供測定用。

苦蕎種子的萌發(fā)容器是用細(xì)棉線交叉綁在搪瓷托盤上，將濕潤的紗布鋪在細(xì)棉線上，搪瓷托盤底部盛去離子水，紗布被棉線架空不與搪瓷托盤底部的去離子水接觸，其中所用萌發(fā)器具和萌發(fā)空間均用75%的乙醇溶液消毒。

1．2．2 苦蕎種子萌發(fā)狀況的測定

測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及7 d內(nèi)萌發(fā)種子的芽長是根據(jù)GB/T 3543．4—1995農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)中所述的方法。

發(fā)芽勢=4 d發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率=7 d發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

測定不同鹽溶液浸種后萌發(fā)7 d內(nèi)苦蕎種子中粗蛋白含量是根據(jù)GB 5009．5—2010食品中蛋白質(zhì)的測定中所述的凱氏定氮法并稍加改動(dòng)。

1．2．3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1．2．3．1 單因素試驗(yàn)

萌發(fā)中浸種鹽液的種類及其濃度:本試驗(yàn)選用3種無機(jī)鹽作為萌發(fā)時(shí)浸種的溶液進(jìn)行試驗(yàn)對比，分別為硫酸鋁溶液(濃度梯度為100、500、1 000、2 000、4 000 mg/L)、硫酸鋅溶液(濃度梯度為100、300、500、700、900 mg/L)和硫酸銅溶液(濃度梯度為20、40、60、100、200 mg/L)。試驗(yàn)條件為萌發(fā)溫度25℃，萌發(fā)時(shí)間72 h。

萌發(fā)溫度:分別以15、20、25、30、35℃為萌發(fā)溫度進(jìn)行試驗(yàn)對比。浸種液均為水，萌發(fā)時(shí)間為72 h。

萌發(fā)時(shí)間:分別以48、60、72、84、96 h為萌發(fā)溫度進(jìn)行試驗(yàn)對比。浸種液均為水，萌發(fā)時(shí)間為25℃。

1．2．3．2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定上述3因素的上下臨界限，按照L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1．2．3．3 萌發(fā)苦蕎中總黃酮類物質(zhì)的提取與測定

總黃酮類物質(zhì)的測定方法是采用NY/T 1295—2007蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定中所述方法并稍加改動(dòng)［19］。

提供取粉碎后樣品0．2 g，精確至0．000 1 g，置于150 mL具塞三角瓶中，加入70%甲醇溶液30 mL，將三角瓶置于(65±2)℃的恒溫水浴震蕩器中在(130±10)r/min的振蕩頻率下振搖6 h，趁熱用離心機(jī)于3 000 r/min離心，上清液置于50 mL容量瓶中，冷卻至室溫，用70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，為試樣待測液。

采用分光光度法，以標(biāo)準(zhǔn)蘆丁為參照物進(jìn)行測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:用移液管分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0．25、0．50、1．0、2．0、3．0、4．0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入三氯化鋁溶液2 mL、乙酸鉀溶液3 mL，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，室溫下放置30 min。同時(shí)做空白。標(biāo)準(zhǔn)曲線中蘆丁含量分別為0．001 25、0．002 50、0．005 00、0．010 0、0．015 0、0．020 0 mg/mL。在波長420 nm處測定吸光度。以吸光度值為橫坐標(biāo)，濃度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中總黃酮含量的測定:準(zhǔn)確吸取1．0 mL試料待測液置于10 mL容量瓶，其他操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制相同。

1．2．3．4 萌發(fā)苦蕎中金屬鹽離子殘留的測定

鋁離子殘留量的測定采用GB/T 5009．182—2003面制食品中鋁的測定中所述方法［20］并稍加改動(dòng)。銅離子和鋅離子殘留量的測定方法是采用GB/T 14609—2008糧油檢驗(yàn)谷物及其制品中銅、鐵、錳、鋅、鈣、鎂的測定火焰原子吸收光譜法［21］。

1．2．4 統(tǒng)計(jì)方法

相關(guān)數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理，P＜0．05為差異顯著，P＜0．01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同浸種液及萌發(fā)時(shí)間對苦蕎種子生長狀況的影響

種子浸種后，按照1．2．1和1．2．2中所述方法在25℃下對苦蕎種子進(jìn)行7 d萌發(fā)并測定其發(fā)芽勢、發(fā)芽率和芽長，結(jié)果見表1，圖1。萌發(fā)狀況的測定中Al3+、Zn2+和Cu2+質(zhì)量濃度分別為1 000、500和60 mg/L，對照組浸種液為水。

表1 不同溶液浸種萌發(fā)后苦蕎種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

苦蕎種子在萌發(fā)12 h后均吸水膨脹，偶有露白，12～24 h中大部分種子有出芽現(xiàn)象，芽長約0．2 cm。從表1中可以看出，與水浸種萌發(fā)相比，金屬鹽浸泡萌發(fā)對苦蕎種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率并無顯著影響，3種鹽溶液在發(fā)芽勢和發(fā)芽率也沒有明顯的區(qū)別。

但由圖1中可知，較水浸種萌發(fā)，經(jīng)鹽溶液浸種后的種子芽長更長，同樣時(shí)間內(nèi)生長速度更快，得到的芽體更多。另外，3種鹽溶液中鋁鹽浸種后的芽體生長情況最好，萌發(fā)7 d時(shí)芽體長達(dá)7．34 cm，比水浸種萌發(fā)7 d時(shí)增加了22．07%，有利于增加產(chǎn)量，而鋅與銅鹽浸種后效果區(qū)別不大，但都優(yōu)于水浸中的效果。綜上所述，經(jīng)鹽溶液浸種的苦蕎種子芽體生長比水浸種后種子生長速度快，同時(shí)間內(nèi)芽體更長。

圖1 不同溶液浸種萌發(fā)后苦蕎種子的芽長

2．2 不同浸種液及萌發(fā)時(shí)間對苦蕎種子中粗蛋白及黃酮含量的影響

2．2．1 浸種液及萌發(fā)時(shí)間對粗蛋白含量的影響

經(jīng)測定，本試驗(yàn)所用原料中所含粗蛋白含量為17．76 g/100 g DW?？嗍w種子經(jīng)水浸種后，萌發(fā)0～1 d時(shí)，蛋白質(zhì)含量略有下降，1～4 d時(shí)蛋白質(zhì)含量隨萌發(fā)時(shí)間的延長而增加，于第4天時(shí)達(dá)最大值19．52 g/100 g DW，之后5～7 d隨萌發(fā)時(shí)間延長，蛋白質(zhì)含量下降，至第7天含量下降至15．85 g/100 g DW。而經(jīng)鋁、銅、鋅溶液浸種后的苦蕎種子，萌發(fā)0～2 d時(shí)，蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降，隨后2～7 d，經(jīng)鋁和銅溶液浸種后的種子蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間延長而增加，至第7天含量達(dá)最大值，分別為21．87、22．95 g/100 g DW，而經(jīng)鋅溶液浸種后的種子蛋白質(zhì)含量在2～6 d中持續(xù)增加，至第6天達(dá)最大值21．20 g/100 g DW，之后含量急劇下降。綜上所述，鹽溶液浸種對萌發(fā)的苦蕎種子萌發(fā)后期蛋白質(zhì)分解用于芽體自身生長起到了一定抑制的作用，并在萌發(fā)過程中有利于蛋白質(zhì)含量的增加。但增加的蛋白質(zhì)是否易于消化吸收則有待于做進(jìn)一步的探討。

圖2 苦蕎種子經(jīng)不同鹽溶液浸種后萌發(fā)7d內(nèi)粗蛋白含量

2．2．2 浸種鹽液的種類及其濃度對苦蕎種子中總黃酮含量的影響

未萌發(fā)的苦蕎種子中總黃酮含量為572．3 mg/100 g DW。

不同浸種鹽液及其濃度對苦蕎中總黃酮含量的影響見圖3，萌發(fā)溫度和時(shí)間均為25℃、84 h。

圖3 不同質(zhì)量濃度的3種鹽溶液浸種后對總黃酮含量的影響

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，用硫酸鋁溶液浸種時(shí)，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，樣品中總黃酮含量最高，比未萌發(fā)樣品中總黃酮含量增加125．15%，比用水浸種萌發(fā)后所得樣品含量增加21．92%，隨著硫酸鋁溶液濃度增大，其總黃酮含量減小，并趨于平緩;用硫酸鋅溶液浸種時(shí)，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為500 mg/L，樣品中總黃酮含量達(dá)最大值，比未萌發(fā)樣品含量增加116．84%，與水浸種相比增加17．46%;用硫酸銅溶液浸種時(shí)，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度增至60 mg/L時(shí)，樣品中總黃酮含量最高，比未萌發(fā)樣品含量增加118．35%，比水浸種增加24．53%，之后含量隨濃度增加而下降并趨于穩(wěn)定。

綜上所述，用所選3種鹽溶液浸種后的萌發(fā)苦蕎中所含總黃酮含量與未萌發(fā)種子相比均大幅度增加。每種溶液最佳濃度有所不同，Al、Zn、Cu 3種鹽液浸種的最佳質(zhì)量濃度分別為1 000、500、60 mg/L。3種鹽液低濃度浸種時(shí)，萌發(fā)種子中總黃酮含量均比水浸種含量略低，但隨著濃度適量增加，總黃酮含量大幅度增加，浸種鹽液濃度繼續(xù)增加，總黃酮含量反而呈現(xiàn)出了下降的趨勢，并趨于平緩。另外，此處所選3種浸種鹽對于促進(jìn)種子總黃酮含量增加的原理并不相同，Al鹽是對種子產(chǎn)生毒害機(jī)制，使種子對其產(chǎn)生抗逆性而增加植物中對人類有益成分的含量;而Zn是種子生長所必需一種元素，用Zn鹽浸種可使種子生長速度加快;Cu既是種子生長的必需元素，在一定濃度下也會(huì)對種子產(chǎn)生毒害機(jī)制，從兩個(gè)方面對種子進(jìn)行脅迫。

2．2．3 萌發(fā)時(shí)間與萌發(fā)溫度對苦蕎種子中總黃酮含量的影響

由圖4a可以發(fā)現(xiàn)，隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，苦蕎種子中的總黃酮含量呈增長趨勢，48～60 h階段增長速度較為緩慢，至72 h時(shí)含量比60 h時(shí)大幅度增加，與水浸中相比增加到72～96 h階段含量雖有增加，但速度緩慢，萌發(fā)96 h時(shí)總黃酮含量僅比72 h增加5．53%。但是，過長的萌發(fā)時(shí)間會(huì)提高種子霉變的幾率，影響芽體的生長，污染其他種子，使種子的萌發(fā)過程不易控制，因此種子的萌發(fā)時(shí)間不宜超過96 h。

圖4 萌發(fā)時(shí)間與萌發(fā)時(shí)間對總黃酮含量的影響

由圖4b中可見，當(dāng)溫度為25℃是，種子中總黃酮含量最高;當(dāng)溫度為30℃時(shí)，種子中總黃酮含量呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢?？嗍w為耐寒植物，較高的溫度不適合苦蕎種子的生長。

2．3 萌發(fā)苦蕎的工藝優(yōu)化試驗(yàn)

通過對苦蕎種子中總黃酮含量的單因素分析，得出如下工藝參數(shù)范圍:浸種鹽液為1 000 mg/L的硫酸鋁溶液、500 mg/L的硫酸鋅溶液和60 mg/L的硫酸銅溶液;萌發(fā)時(shí)間為60～84 h;萌發(fā)溫度為20～30℃。為了得到最佳的提取效果，以苦蕎種子中總黃酮含量作為指標(biāo)，對上述因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 因素水平表

由表2可以發(fā)現(xiàn)，影響因素的顯著性大小關(guān)系為:萌發(fā)溫度＞萌發(fā)時(shí)間＞浸種鹽種類。

表2 優(yōu)化試驗(yàn)以及直觀差分析表

由表3可知，3個(gè)因素均對苦蕎種子中的總黃酮含量有顯著性影響，其中萌發(fā)溫度對其有非常顯著的影響。由此可確定使用鹽浸種萌發(fā)苦蕎種子的最佳條件為:浸種鹽為1 000 mg/L硫酸鋁溶液，萌發(fā)時(shí)間為84 h，萌發(fā)溫度為25℃。在此工藝下，苦蕎種子中的總黃酮含量可以達(dá)到1 347．1 mg/100 g DW，比未萌發(fā)種子中的含量增加了135．38%。

表3 結(jié)果方差分析表

由于在種子浸種吸水的過程中運(yùn)用了金屬離子鹽溶液浸種，因此分別對正交中3種離子的最優(yōu)結(jié)果即最佳條件所得樣品、9號(hào)樣品和4號(hào)樣品進(jìn)行了Al、Cu和Zn元素殘留量的測定。結(jié)果表明，最佳條件所得樣品中Al元素殘留量為13．110 mg/kg，9號(hào)樣品中Cu元素殘留量為8．096 mg/kg，4號(hào)樣品中Zn元素殘留量為44．07 mg/kg，均小于GB 2760—2011［22］和NY 861—2004［23］中Al、Cu、Zn元素的限量(分別為100，10，50 mg/kg)。因此，使用這3種金屬鹽離子浸種萌發(fā)不但使苦蕎中的功能性物質(zhì)總黃酮含量大幅度增加，而且并未使其中Al、Zn和Cu元素含量超標(biāo)。

3 討論與結(jié)論

苦蕎種子在萌發(fā)12 h后均吸水膨脹，偶有露白，12～24 h中大部分種子有出芽現(xiàn)象，芽長約0．2 cm。相較于水浸種萌發(fā)，一定濃度的鹽溶液浸種萌發(fā)對苦蕎種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率沒有顯著的影響，但對于種子芽體生長的影響較為顯著，其中鋁離子浸種后萌發(fā)的效果最好，鋅與銅的效果次之。但是，過高的鹽溶液濃度可能由于其本身毒性過大而對苦蕎的萌發(fā)起到一定的抑制作用，從而使苦蕎中的發(fā)芽率和芽苗產(chǎn)量降低，而過低的鹽溶液濃度有可能因有效元素含量過低而對其萌發(fā)的影響不顯著［24］。因此，浸種鹽液的濃度還需進(jìn)一步研究。

經(jīng)鹽溶液浸種后的苦蕎種子在萌發(fā)0～4 d內(nèi)蛋白質(zhì)含量比水浸種中含量增加速度慢。但在4～7天，經(jīng)水浸種的種子中的蛋白質(zhì)含量由第4天的最大值開始隨時(shí)間增加而下降，而經(jīng)鹽溶液浸種后的種子中含量則以不同速度增加，并且分別在第6天和第7天達(dá)最大值。由此可見，相較于水浸種，金屬鹽離子浸種可使苦蕎種子在萌發(fā)中后期蛋白質(zhì)含量顯著增加，但其蛋白構(gòu)成的變化及其消化率則需做進(jìn)一步研究。

對比多種不同濃度的鹽溶液的浸種萌發(fā)效果，由此可以確定各種鹽溶液的最佳濃度，3種鹽溶液的最佳萌發(fā)濃度分別為:硫酸鋁溶液1 000 mg/L，硫酸鋅溶液500 mg/L，硫酸銅溶液60 mg/L。經(jīng)正交分析后，得出的最佳萌發(fā)工藝條件為:浸種鹽種類為1 000 mg/L硫酸鋁溶液，萌發(fā)時(shí)間為84 h，萌發(fā)溫度25℃。在此工藝下，苦蕎種子中總黃酮含量可以達(dá)到1 347．1 mg/L，比未萌發(fā)種子中的含量提高了135．38%，與傳統(tǒng)水浸中萌發(fā)后含量提高了27．45%。同時(shí)對樣品中的鋁、銅、鋅元素殘留量進(jìn)行檢測，與國標(biāo)限量相比并未超標(biāo)。

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Effect of Metallic Ions on Germination and Seedlings Physiology and the Content of Flavones in Black Tartary Buckwheat

Li Xiaodan Wang Li Wang Ren Chen Zhengxing
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology/Jiangnan University，Wuxi 214122)

The influence of aluminum，zinc and copper on the seedling physiology，crude protein and total flavones of black tartary buckwheat was studied．Absorptiophotometry was applied to determine the content of total flavones in black tartary buckwheat through L9(34)orthographic experiments．The result showed that the effect of Al，Zn and Cu solution played a notable role in the length and the content of protein of the seeds increasing during the germination stage，whereas had few influences on seed germination and its rate;based on the consequences of the single factor and orthographic experiments，the best germination processing parameter was ascertained as follows:the steeping solution 1 000 mg/L aluminum sulfate solution，germination time 84 h，temperature 25℃．In the above－mentioned condition，the content of total flavones in black tartary buckwheat would increase to 1 347．1 mg/100 g(DW)．

back tartary buckwheat，germination，protein，total flavones

S517

A

1003－0174(2012)10－0026－06

2012－12－20

李曉丹，女，1988年出生，碩士，糧食油脂及植物蛋白

陳正行，男，1960年出生，教授，谷物化學(xué)