藍(lán)莓多酚的萃取及抗氧化活性研究

程安瑋， 房 凱， 王文亮， 劉麗娜， 靳 瓊

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南 250100)

藍(lán)莓多酚的萃取及抗氧化活性研究

程安瑋， 房 凱， 王文亮， 劉麗娜， 靳 瓊

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南 250100)

研究了不同萃取溶劑及pH值對藍(lán)莓中可萃取多酚(EPP)和不可萃取多酚(NEPP)萃取率的影響，并用DPPH法研究了這兩類多酚的抗氧化活性．結(jié)果表明，加入甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑可明顯提高EPP的萃取率，其中以50%乙醇的萃取率最高．采用硫酸水解法分離制備NEPP，結(jié)果表明，藍(lán)莓的NEPP含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EPP．EPP的抗氧化活性與其含量呈正相關(guān)性．萃取溶液pH值對EPP萃取率具有明顯的影響，pH值越低，可萃取率越高．

藍(lán)莓;可萃取多酚;不可萃取多酚;抗氧化活性

藍(lán)莓屬于杜鵑花科越橘屬植物，因其具有較高的保健營養(yǎng)價(jià)值，所以風(fēng)靡世界，被譽(yù)為“黃金漿果”．我國對藍(lán)莓的研究始于20世紀(jì)80年代初，到目前，我國種植總面積達(dá)到上千公頃．藍(lán)莓近些年來引起人們的廣泛關(guān)注，最主要的就是多酚含量很高，并賦予其獨(dú)特的活性．研究證明:藍(lán)莓具有抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用，這些作用主要是由高含量的多酚所介導(dǎo)的［1］．2007年，Saura-Calixto等［2］指出總多酚(total polyphenols，TPP)是指可萃取多酚(extractable polyphenols，EPP)和不可萃取多酚(non-extractable polyphenols，NEPP)的總和．目前對植物多酚的研究主要集中在EPP，而很少關(guān)注NEPP．如果考慮NEPP，水果中有益多酚如原花青素、鞣花酸、兒茶酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們的估計(jì)．目前這些NEPP一直不被列為食物的營養(yǎng)組成，實(shí)際上這些NEPP是食物中具有生物活性的成分，可被結(jié)腸中細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對人體十分有益．有關(guān)NEPP早在1973年就有研究，但由于缺乏合適的分析研究方法，一直沒有引起人們的注意［3］．

多酚的萃取方法主要有微波萃取、超聲萃取、膜分離、超臨界萃取等，但提取率受酚類物質(zhì)復(fù)雜的組成、不同聚合度以及原料結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異等諸多因素影響．藍(lán)莓中的多酚比其他果類高，特別是花青素的含量在所有果蔬原料中是最高的，但目前國內(nèi)對多酚的研究主要集中在可萃取多酚含量差異、抗氧化等方面［4－5］．本研究以新鮮藍(lán)莓為實(shí)驗(yàn)原料，采用超聲萃取的方法，比較不同萃取溶劑及溶劑的pH值對藍(lán)莓EPP萃取率的影響，然后用硫酸加熱水解出NEPP，測定NEPP的含量，進(jìn)一步采用DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)法比較EPP和NEPP的抗氧化活性及差異，以期為藍(lán)莓多酚的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

8月份從當(dāng)?shù)爻匈徺I的新鮮成熟的高叢藍(lán)莓(Vaccinium corymbosum L．)，用組織勻漿機(jī)打成漿后真空冷凍干燥成粉狀，貯藏備用．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

RF-5301PC型可見分光光度計(jì)，日本島津公司;組織勻漿機(jī)，飛利浦公司;FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司．

1.3 試劑

2N福林酚試劑和標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸(gallic acid)，Sigma 公司;Na2CO3、H2SO4、HCl、甲醇、乙醇、丙酮及DPPH均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藍(lán)莓EPP的制備

稱取約0.3 g干燥的藍(lán)莓粉放于具塞試管中，按質(zhì)量(g)體積(mL)比為1∶30加入不同的萃取溶劑，萃取溶劑的pH值用2 mol/L的鹽酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，擰緊瓶塞，超聲提取1 h，頻率為400 Hz，溫度為45℃，4 000 r/min離心5 min，分離上層液和沉淀，重復(fù)提取兩次，合并上清液，并測定萃取液中EPP的含量．

1.4.2 藍(lán)莓NEPP的制備

將提取EPP后的藍(lán)莓沉淀在40℃下干燥后稱重，置于帶塞的試管中，加入5 mL體積比為90∶10的甲醇/H2SO4萃取液，擰緊瓶塞，在80℃水浴中加熱 20 h，冷卻后 4 000 r/min 離心 5 min［6］，測定上清液中NEPP的含量．

TPP為EPP和NEPP之和．

1.4.3 多酚含量的測定

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法［7］．取100 μL多酚萃取液，加2 mL蒸餾水，再加200 μL福林酚試劑混勻，3 min后加900 μL Na2CO3(20 g/mL)混勻，在暗處放置2 h后，于分光光度計(jì)測定765 nm處吸光度．以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在10×10－6～500×10－6內(nèi)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚的含量，結(jié)果表示為mg/g DW(DW為干物質(zhì)重)．每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果以±s表示．

1.4.4 清除DPPH自由基能力的測定

取0.5 mL多酚提取液與2.5 mL DPPH溶液(250 μmol/L，用甲醇配制)混合，室溫下避光放置60 min，在517 nm處測定吸光度值(A1)，以萃取溶劑替代萃取液作為空白對照，同時(shí)測定純DPPH溶液的吸光度值(A0)［8］．

清除自由基的能力=［(A0－A1)/A0］×100%．

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件對測定結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(p＜0.05)．

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取溶劑對藍(lán)莓多酚萃取率的影響

首先研究不同萃取溶劑對藍(lán)莓中多酚萃取率的影響，如表1．

表1 萃取溶劑對藍(lán)莓中EPP和NEPP萃取率的影響Tab．1 Effect of solvent on EPP and NEPP contents mg/g DW

由表1可知，水中加入一定比例的有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、丙酮)，可明顯提高EPP的萃取率．添加甲醇實(shí)驗(yàn)組，隨著甲醇體積比的降低，EPP萃取率呈增加的趨勢，乙醇組也表現(xiàn)出相同的趨勢．添加丙酮實(shí)驗(yàn)組中，以丙酮體積分?jǐn)?shù)為75%的EPP萃取率最高，當(dāng)純丙酮作為萃取溶劑時(shí)，EPP萃取率最低，甚至比以純水為溶劑所萃取的EPP還低，僅有3.32±0.21 mg/g DW，只有最大值的1/3(50%乙醇組)．總的來看，萃取溶劑中添加一定比例的乙醇，EPP的萃取率相對較高，特別是乙醇體積為50%時(shí)，EPP的萃取率最大，為10.65±1.49 mg/g DW．

藍(lán)莓提取EPP后的沉淀，用甲醇/H2SO4加熱水解得到NEPP，并測定其含量．結(jié)果表明，藍(lán)莓中NEPP的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EPP的含量，甚至超過7倍，最高的含量達(dá)到23.63±1.22 mg/g DW．NEPP的含量變化趨勢與EPP的相反，也就是說，EPP含量相對較高的實(shí)驗(yàn)組中，經(jīng)過加熱水解，NEPP的含量相對較低．各實(shí)驗(yàn)組中NEPP的含量為18.90±0.15 mg/g DW至23.63±1.22 mg/g DW．

將EPP和NEPP相加，得到TPP的含量．從得到的數(shù)據(jù)看，各實(shí)驗(yàn)組中TPP的含量為26.95～29.55 mg/g DW，相差不大，平均得到藍(lán)莓中總多酚的含量約為28.41 mg/g DW．

2.2 不同萃取溶劑對藍(lán)莓多酚抗氧化能力的影響

將分離的EPP與NEPP進(jìn)行抗氧化能力的測定，結(jié)果見表2．可萃取部分對DPPH清除自由基的能力與其濃度呈正相關(guān)，EPP的含量越高其對自由基的清除能力越強(qiáng)，NEPP對自由基的清除能力要低于可萃取部分．低pH值的溶液可降低多酚自由基的清除能力，酸度值越低，所表現(xiàn)的自由基清除能力越低．由于NEPP是用硫酸水解所得，各組的酸度很大且差別不大，除了100%的丙酮組，其余各組所表現(xiàn)的DPPH自由基清除能力差別不大．

有關(guān)多酚含量與其抗氧化能力之間的相關(guān)性研究較多，大量的研究證明多酚的濃度與抗氧化性呈現(xiàn)很好的正相關(guān)性［9－10］，但 Sellappan 等［11］的實(shí)驗(yàn)表明，兩者之間的相關(guān)性較差．由于受酸度的影響，NEPP所表現(xiàn)的抗氧化活性相比EPP的偏低，且各實(shí)驗(yàn)組之間差別不明顯．

表2 萃取溶劑對藍(lán)莓中多酚抗氧化能力的影響Tab．2 Effect of solvent on antioxidant activity of polyphenols%

2.3 pH值對藍(lán)莓多酚萃取率的影響

根據(jù)2.1中分析結(jié)果，選用EPP萃取率最高的組，50%乙醇作為萃取溶液，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)萃取溶液的pH值，研究萃取溶液的pH值對多酚萃取率的影響，結(jié)果見表3．溶液的pH值對EPP的萃取率有一定的影響，降低溶液的pH值有利于EPP的萃取．同樣NEPP的含量明顯高于EPP，NEPP的變化趨勢與EPP的變化趨勢相反，EPP萃取率較高的組，NEPP的萃取率就相對較低．計(jì)算TPP的含量，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中TPP含量沒有差別，與2.1的結(jié)果是一致的．

表3 溶液pH值對藍(lán)莓中EPP和NEPP的影響Tab．3 Effect of pH on EPP and NEPP contents mg/g DW

2.4 pH值對藍(lán)莓多酚抗氧化能力的影響

進(jìn)一步研究萃取溶劑pH值對藍(lán)莓中多酚清除DPPH自由基能力的影響，結(jié)果見表4．由表4可知，pH值可明顯影響多酚對自由基的清除能力，EPP的濃度與抗氧化能力間不呈正相關(guān)性，溶液的pH值越高，所表現(xiàn)的清除自由基能力越強(qiáng)．NEPP所表現(xiàn)的清除自由基能力低于可萃取部分，這主要是在制備NEPP時(shí)，水解液中加入10%的硫酸，強(qiáng)酸可能影響DPPH反應(yīng)體系．許申鴻等［12］研究證明，pH值對DPPH抗氧化體系的影響較大，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿使DPPH溶液迅速失效，在pH值為2～10時(shí)物質(zhì)的抗氧化活性隨pH值的升高而降低［12］．

表4 溶液pH值對藍(lán)莓多酚抗氧化能力的影響Tab．4 Effect of pH on antioxidant activity of polyphenols%

3 結(jié)論

通過研究不同萃取溶劑及pH值對藍(lán)莓中多酚萃取率及抗氧化活性的影響，得出結(jié)論．

1)萃取溶液中加入甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑可明顯提高EPP的萃取率，添加乙醇的效果要好于甲醇和丙酮，以50%乙醇的萃取率最好．

2)采用甲醇/H2SO4加熱水解的方法，首次研究了藍(lán)莓中的NEPP，且NEPP的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EPP的含量．

3)EPP含量較高的組，其NEPP的含量則相對較低，但總多酚的含量差別不大．

4)EPP的抗氧化活性與其濃度呈正相關(guān)，這表明藍(lán)莓的抗氧化作用主要是由高濃度多酚所介導(dǎo)的，多酚是表現(xiàn)高抗氧化性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)．

5)溶液的pH值對EPP的萃取率也有明顯的影響，提高溶液的酸度，可提高EPP的萃取率，溶液的pH值也影響多酚的抗氧化能力，酸度越低，表現(xiàn)的抗氧化能力越高，NEPP所表現(xiàn)的抗氧化性與多酚的濃度不呈正相關(guān)，這主要受溶液酸度的影響．

［1］Seeram N P．Berry fruits for cancer prevention:current status and future prospects［J］．J Agric Food Chem，2008，56:630-635．

［2］Saura-Calixto F，Sereano J，Goňi I．Intake and bioaccessibility of total ployphenols in a whole diet［J］．Food Chem，2007，101:492-501．

［3］Bate-Smith E C．Tannins of herbaceous legumiae［J］．Phytochemistry，1973，12:1809-1812．

［4］解利利，張慜，孫金才．藍(lán)莓凍果多酚粗提物體外抗氧化活性的研究［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30(6):818-821．

［5］劉文旭，黃午陽，曾曉雄，等．草莓、黑莓、藍(lán)莓中多酚類物質(zhì)及其抗氧化活性研究［J］．食品科學(xué)，2011，32(23):130-133．

［6］Arranz S，Saura-Calixto F，Shaha S，et al．High contents of nonextractable polyphenols in fruits suggest that polyphenol contents of plant foods have been underestimated［J］．J Agric Food Chem，2009，57:7298-7303．

［7］Slimkard K，Singleton V L．Total phenol analysis and comparison with manual method［J］．Am J Enol Viticult，1977，28:49-55．

［8］Sun T，Tang J，Powers J R．Effect of pectolytic enzyme preparations on the phenolic composition and antioxidant activity of asparagus juice［J］．J Agric Food Chem，2005，53(1):42-48．

［9］Santas J，Carbó R，Gordon M H，et al．Comparison of the antioxidant activity of two Spanish onion varieties［J］．Food Chem，2008，107:1210-1216．

［10］Djeridane A，Yousfi M，Nadjemi B，et al．Antioxidant activity of some algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds［J］．Food Chem，2006，97(4):654-660．

［11］Sellappan S，Akoh C C．Flavonoids and antioxidant capacity of Georgia-grown Vidalia onions［J］．J Agric Food Chem，2002，50(19):5338-5342．

［12］許申鴻，杭瑚．溶劑及pH值對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基分析法的影響［J］．分析測試學(xué)報(bào)，2000，19(3):50-52．

(責(zé)任編輯:葉紅波)

Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols in Blueberries

CHENG An-wei， FANG Kai， WANG Wen-liang， LIU Li-na， JIN Qiong
(Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China)

The effect of solvent and pH on the contents of extractable polyphenols(EPP)and non-extractable polyphenols(NEPP)of blueberries was investigated in this paper．The antioxidant activity of polyphenols was also determined by DPPH system．The results showed that the solvent containing methanol，ethanol and acetone can enhance the EPP contents，especially 50%ethanol．The NEPP contents isolated by the hydrolysis of sulfuric acid were much higher than that of EPP．There is a good correlation between the antioxidant activity and the EPP content．The yield of EPP increased with the decreasing of pH．

blueberry;extractable polyphenols;non-extractable polyphenols;antioxidant activity

TS225.2

A

1671-1513(2012)04-0037-04

2012-03-16

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(31101270)．

程安瑋，女，副研究員，博士，主要從事食品新資源開發(fā)方面的研究工作;

王文亮，男，副研究員，主要從事果蔬加工方面的研究工作．通訊作者．