方勤

（重慶市涪陵區(qū)義和鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶涪陵 408104）

目前隨著生豬養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，生豬防疫工作的進(jìn)一步縱向深化，口蹄疫、豬瘟、高致病性藍(lán)耳病等重大疫病免疫逐漸在從重點(diǎn)免疫向全面免疫轉(zhuǎn)變、從季節(jié)性免疫向常年免疫轉(zhuǎn)變、從注重密度向既注重密度又注重質(zhì)量轉(zhuǎn)變。特別是在生豬規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)于一些傳染性比較強(qiáng)、危害性比較大的疾病，選擇預(yù)防接種已經(jīng)成為防控這類疾病的關(guān)鍵。但是由于疫苗免疫是一個(gè)復(fù)雜，影響因素極多的過(guò)程，當(dāng)疫苗接種到動(dòng)物體內(nèi)后，必須要經(jīng)過(guò)動(dòng)物機(jī)體本身的一系列復(fù)雜反應(yīng)，機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)才能夠產(chǎn)生保護(hù)力。而這種保護(hù)力往往容易受到除了疫苗以及動(dòng)物機(jī)體本身的影響。對(duì)于生豬養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫程序是不能一層不變的，適合于該場(chǎng)的免疫程序也許經(jīng)過(guò)兩三年就會(huì)不太適合，必須根據(jù)情況隨時(shí)加以調(diào)整。一些養(yǎng)殖場(chǎng)照搬別場(chǎng)免疫程序或連年不變的做法難免會(huì)造成失誤而引發(fā)該場(chǎng)發(fā)病，從而造成本區(qū)域內(nèi)生豬疫病的流行。因此，若有條件應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)生豬的實(shí)際抗體水平為依據(jù)，并結(jié)合當(dāng)?shù)氐膶?shí)際情況，制定適合于本場(chǎng)的免疫程序。

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，它是由豬瘟病毒引起的一種高度接觸性傳染病。豬瘟病毒（CSFV）屬于黃病毒科豬瘟病毒屬，CSFV為單股正鏈RNA有囊膜病毒。自1833年首次在美國(guó)俄亥俄州發(fā)現(xiàn)CSF。近百年以來(lái)，一直在全世界范圍內(nèi)流行，也是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。中國(guó)自主研制的豬瘟兔化弱毒疫苗在防治CSF過(guò)程中具有很重要的作用，但近年來(lái)各地生豬養(yǎng)殖場(chǎng)仍有CSF免疫效果不理想的情況出現(xiàn)。

豬瘟抗體檢測(cè)的方法很多，基本都是以病毒中和試驗(yàn)為基礎(chǔ)，目前使用最廣泛的檢測(cè)CSF血清抗體的ELISA方法，包括了檢測(cè)豬瘟病毒的粗蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，其中使用最廣泛的是CSFV E2 ELISA，即檢測(cè)豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2的ELISA，此次我們用來(lái)檢測(cè)豬瘟抗體的試劑盒就是使用的這種檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法的特異性能達(dá)到99%。E2蛋白是CSFV的一個(gè)囊膜糖蛋白，分子量大小為51～58kDa，是豬瘟病毒里三個(gè)病毒糖蛋白之一，也是豬瘟病毒的主要抗原蛋白。E2蛋白分子內(nèi)的1 5個(gè)Cys殘基屬于E2蛋白的保守區(qū)域，其中N端6個(gè)Cys殘基主要參與了抗原蛋白結(jié)構(gòu)域的形成，C端9個(gè)Cys殘基則參與同源、異源二聚體的形成，屬于E2蛋白的變異區(qū)域。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。FMD主要侵害偶蹄獸，最易感染的動(dòng)物是黃牛、水牛、豬、駱駝、羊、鹿等；黃羊、麝、野豬、野牛等野生動(dòng)物也易感染此病。FMD的臨床癥狀是以病畜全身發(fā)熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發(fā)生水泡和潰爛為特征，是國(guó)際獸疫局規(guī)定的A類傳染病，易通過(guò)空氣傳播，傳染性強(qiáng)、發(fā)病急、危害大等流行特點(diǎn)。FMD傳播無(wú)明顯的季節(jié)性，春秋兩季較多。FMDV屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，它有七個(gè)血清型且各型之間無(wú)交叉保護(hù)反應(yīng)。FMDV含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分 別 為 VP1、VP2、VP3和 VP4，其中VP1蛋白上不僅存在著FMDV主要的抗原位點(diǎn)，還含有病毒受體結(jié)合區(qū)。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的特征是豬群發(fā)生以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病。高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱藍(lán)耳?。┎《咀儺愔暌鸬囊环N急性高致死性疫病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上，育肥豬也可發(fā)病死亡是其特征。PRRSV為動(dòng)脈炎病毒屬的成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈球型，直徑為55～60 nm，病毒有2個(gè)血清型，即美洲型和歐洲型，我國(guó)分離到的毒株為美洲型。

豬偽狂犬病（PR）是由偽狂犬病毒(PRV)引起的一種傳染病。該病最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，后來(lái)由匈牙利科學(xué)家首先分離出病毒。偽狂犬病毒PRV屬于皰疹病毒科豬皰疹病毒屬，病毒粒子為圓形，直徑150～180 nm，核衣殼直徑為105～110 nm。病毒粒子的最外層是病毒囊膜，它是由宿主細(xì)胞衍生而來(lái)的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。囊膜表面有長(zhǎng)約8～10 nm呈放射狀排列的纖突。偽狂犬病毒V只有一個(gè)血清型，但不同毒株在毒力和生物學(xué)特征等方面存在差異。血清學(xué)鑒別診斷豬偽狂犬病病毒的方法，是在使用基因標(biāo)志疫苗的基礎(chǔ)上應(yīng)用的一類診斷方法。由于PRV中存在多個(gè)非心需糖蛋白基因，缺失這些基因的病毒突變株從而不能產(chǎn)生被缺失基因所編碼的糖蛋白，但是缺失的糖蛋白并不能影響病毒在細(xì)胞上的增殖與免疫原性。將這種基因缺失標(biāo)志疫苗注射動(dòng)物后，動(dòng)物不能產(chǎn)生針對(duì)缺失蛋白的抗體。因此，可通過(guò)血清學(xué)方法將自然感染野毒的血清學(xué)陽(yáng)性豬與注苗豬區(qū)分開來(lái)。

一、材料和方法

（一）材料 2011年1月～12月，對(duì)本區(qū)的20個(gè)大型生豬集約化養(yǎng)殖場(chǎng)，按每個(gè)豬場(chǎng)隨機(jī)抽選種母豬以及15～45日齡的仔豬各10頭份，每頭份采集全血3～5 ml，并記錄好各養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫程序。將編號(hào)好的豬血分別移至1.5 ml滅菌EP管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min，共計(jì)獲得了350份合格樣品血清。根據(jù)養(yǎng)殖場(chǎng)的免疫記錄，此次采樣所抽選豬群均未接種豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬傳染性胸膜肺炎的疫苗，有部分豬場(chǎng)在采樣近一個(gè)月內(nèi)曾接種過(guò)豬瘟弱毒苗，另外所有豬場(chǎng)均接種過(guò)豬口蹄疫及豬偽狂犬病毒活疫苗。

（二）方法

1.豬 瘟。HerdChek豬 瘟 抗體檢測(cè)試劑盒（CSFV Ab），有效期至2011年4月30日，購(gòu)自北京愛德士元亨生物科技有限公司。首先將豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒恢復(fù)到室溫18℃～25℃，將待檢血清樣品和陰陽(yáng)性對(duì)照血清用樣品稀釋液做1:1倍稀釋（50 μl樣品血清中加入50 μl樣品稀釋液）并加入豬瘟抗體包被板內(nèi)的檢測(cè)孔中，輕彈反應(yīng)板，使反應(yīng)板中的溶液混勻，在室溫下（18℃～25℃）孵育2 h，300 μl洗滌液洗板3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記（HRPO）的抗豬瘟病毒的酶標(biāo)抗體后室溫下孵育30 min，洗板顯色后加入終止液，然后在450 nm處測(cè)定樣品及對(duì)照的吸光度值，并按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)樣品血清值進(jìn)行判斷。

2.豬口蹄疫。豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒，有效期至2011年4月，購(gòu)自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司。試劑盒使用前恢復(fù)至室溫，對(duì)血清樣品和陰陽(yáng)性血清用樣品稀釋液進(jìn)行1:10倍稀釋后取稀釋后液體加入到抗原包被板內(nèi)的反應(yīng)孔中，將反應(yīng)板放置在37℃下孵育60 min后，用300 μl洗滌液洗滌6次拍干，加入100 μl酶結(jié)合物，37℃孵育30 min后再洗滌一次后加入底物顯色，15 min后加入終止液，然后在450 nm處測(cè)定樣品及對(duì)照的吸光度值，并按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)樣品血清值進(jìn)行判斷。

3.豬繁殖與呼吸綜合征。LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒，有效期至2011年5月，購(gòu)自上海天之泰生物科技有限公司。試劑盒使用前恢復(fù)至室溫，對(duì)血清樣品用樣品稀釋液進(jìn)行1：200倍稀釋然后取50 μl經(jīng)稀釋后的樣品血清加入反應(yīng)板中（陰陽(yáng)性對(duì)照不用稀釋），蓋上膜，將反應(yīng)板放置在37℃下孵育60 min后，用300μl洗滌液洗滌3次拍干，加入50 μl酶標(biāo)抗體，37℃孵育60 min后再洗滌一次后加入底物顯色，10 min后加入終止液，然后在450 nm處測(cè)定樣品及對(duì)照的吸光度值，并按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)樣品血清值進(jìn)行判斷。

4.豬偽狂犬。豬偽狂犬病病毒gpI抗體檢測(cè)試劑盒是用于檢測(cè)豬血清中偽狂犬病病毒（PRV）gpI（又名gpE）抗體，該檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)被檢豬是否曾感染PRV的野毒株和或接種過(guò)含gpI（gpE）抗原的疫苗，根據(jù)涪陵區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際情況，該試劑盒可用來(lái)檢測(cè)PRV野毒株的感染情況。豬偽狂犬病毒（PRV）gB抗體檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)評(píng)估PRV的自然感染或免疫狀況。試驗(yàn)步驟及試驗(yàn)結(jié)果分別按照試劑盒要求進(jìn)行。

二、試驗(yàn)結(jié)果

（一）豬瘟 對(duì)抽選采集的200份生豬血清采用HerdChek豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行豬瘟抗體監(jiān)測(cè)，按照試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，如果被檢樣品的阻斷率大于或等于40%，該樣品就可以判為陽(yáng)性（即有CSFV抗體存在），試驗(yàn)結(jié)果見表1。

（二）豬口蹄疫 對(duì)抽選采集的200份生豬血清采用豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒，被檢樣品OD值≥0.23X陽(yáng)性對(duì)照平均OD值判為陽(yáng)性（即有豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體存在），試驗(yàn)結(jié)果見表2。

（三）豬繁殖與呼吸綜合征 對(duì)抽選的豬血清進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書上的標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

（四）豬偽狂犬病 對(duì)抽選的豬血清進(jìn)行豬偽狂犬病毒gpI（gpE）抗體檢測(cè)，按照試劑盒判斷標(biāo)準(zhǔn)200份豬血清樣品抗體全為陰性。對(duì)抽選的豬血清進(jìn)行豬偽狂犬病毒gpB抗體檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書上的標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

三、分析與討論

200份血清樣品中豬瘟抗體為陽(yáng)性的血清有156份，豬瘟抗體陽(yáng)性率為78%；豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性的血清有176份，豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性率為88%；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（高致病性藍(lán)耳病）抗體陽(yáng)性的血清有68份，豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽(yáng)性率為34%；豬偽狂犬病病毒gI抗體為陽(yáng)性的血清有0份，豬偽狂犬病病毒gB抗體為陽(yáng)性的血清有185份，豬偽狂犬病抗體陽(yáng)性率92.50%。

按試驗(yàn)結(jié)果，豬瘟免疫抗體合格率達(dá)到100%，仔豬抗體合格率為56%。養(yǎng)豬生產(chǎn)中雖然有質(zhì)量可靠的疫苗用于豬瘟防治，但發(fā)生豬瘟的原因很復(fù)雜，其中免疫時(shí)機(jī)，特別是初免時(shí)間選擇不當(dāng)是重要的原因之一。關(guān)于仔豬出生后其血清中通過(guò)母乳獲得豬瘟抗體的多少及維持時(shí)問(wèn)長(zhǎng)短等問(wèn)題，一直是獸醫(yī)工作者所關(guān)心的，很多人作過(guò)跟蹤監(jiān)測(cè)，其結(jié)果并不具有統(tǒng)一性 。事實(shí)上，仔豬血清中的抗體水平高低和維持時(shí)間長(zhǎng)短受母體、仔豬個(gè)體及飼養(yǎng)管理?xiàng)l件諸多因素的影響，不同的監(jiān)測(cè)對(duì)象有不同的結(jié)果是自然的，也是可以理解的。懷孕母豬豬瘟抗體水平較高時(shí)，仔豬通過(guò)母乳獲得的抗體是足以抵抗豬瘟病毒侵襲的，并且在哺乳期內(nèi)一直能夠保持較高的抗體水平。一般認(rèn)為仔豬的母源抗體半衰期為14 d ，從而確定初免時(shí)間在仔豬21日齡左右，但在生產(chǎn)實(shí)際中，各個(gè)單位應(yīng)該結(jié)合自身的實(shí)際，及時(shí)進(jìn)行抗體效價(jià)的監(jiān)測(cè)，從而確定更合理的免疫時(shí)機(jī)。

表1 涪陵地區(qū)集約化豬場(chǎng)豬瘟血清抗體檢測(cè)結(jié)果

表2 涪陵地區(qū)集約化豬場(chǎng)豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白血清抗體檢測(cè)結(jié)果

表3 涪陵地區(qū)集約化豬場(chǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清抗體檢測(cè)結(jié)果

表4 涪陵地區(qū)集約化豬場(chǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒血清抗體檢測(cè)結(jié)果

種豬口蹄疫VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體種豬免疫合格率為100%，仔豬抗體合格率為88%。涪陵區(qū)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)豬口蹄疫免疫采取的是二針強(qiáng)制免疫，種豬的免疫抗體效價(jià)比仔豬要高。豬偽狂犬病血清抗體檢測(cè)結(jié)果，種豬免疫抗體合格率達(dá)99%，仔豬抗體合格率達(dá)86%。定期監(jiān)測(cè)對(duì)于偽狂犬病的防控和凈化非常關(guān)鍵，偽狂犬病gE基因缺失疫苗的廣泛應(yīng)用及相配套的gE—ELISA鑒別診斷方法的商品化，為偽狂犬病的凈化和定期監(jiān)測(cè)提供了充分的技術(shù)基礎(chǔ)。因此規(guī)模化豬場(chǎng)一定要注重豬群偽狂犬野毒抗體和免疫抗體的定期監(jiān)測(cè)，gE—ELISA可以監(jiān)測(cè)野毒感染，同時(shí)野毒陰性豬群通過(guò)gE—ELISA 可以及時(shí)了解豬場(chǎng)偽狂犬疫苗免疫效果，制定科學(xué)的免疫程序。豬場(chǎng)免疫偽狂犬gE基因缺失疫苗都產(chǎn)生了良好的免疫效果；這些方法和疫苗都可以推廣應(yīng)用，但是為了使豬體免疫力更強(qiáng)，阻止野毒入侵，建議仔豬在首免后，適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫。

此次調(diào)查結(jié)果顯示20個(gè)豬場(chǎng)中所采樣品的豬繁殖與呼吸綜合征免疫抗體合格率種豬達(dá)到68%，仔豬抗體合格率為34%。豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)結(jié)果中，母豬抗體陽(yáng)性水平超過(guò)仔豬，但仍未達(dá)到理想水平，表明養(yǎng)殖場(chǎng)均應(yīng)加強(qiáng)豬繁殖與呼吸綜合征的免疫預(yù)防。豬繁殖與呼吸綜合征有經(jīng)典型和高致病型，疫苗也有經(jīng)典株疫苗和高致病性病毒株疫苗兩種，按照疫苗種類又分為弱毒和滅活疫苗。涪陵區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗除部分場(chǎng)外基本都是采用高致病性病毒株苗，部分生豬養(yǎng)殖場(chǎng)近年來(lái)開始使用弱毒苗，從檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)看，弱毒苗免疫效果比滅活苗效果要好。據(jù)資料報(bào)道，PRRSV即便是在血漿中不存在的情況下，也能在幾個(gè)月里長(zhǎng)時(shí)間感染生豬，而所有的母豬都易感染PRRS。PRRS活疫苗的出現(xiàn)為豬場(chǎng)免疫提供了另一個(gè)選擇，但PRRSV變異大，經(jīng)典毒株和高致病毒株免疫交叉保護(hù)的效果好壞還未有共識(shí)，豬場(chǎng)在弱毒疫苗的選擇上還應(yīng)結(jié)合自身情況考慮毒株。

（略）