杜蘇瑞，向太和，李 朦

（杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江杭州 310036）

生物技術在藥用植物三葉青中的應用研究進展

杜蘇瑞，向太和，李 朦

（杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江杭州 310036）

三葉青是一種珍稀的中草藥，其提取物含有三葉青黃酮、β－谷甾醇和多糖等，具有良好的抗腫瘤作用，臨床上已經用于抗癌、抗艾滋病毒，治療血液病、心腦血管疾病、肝炎和病毒性腦膜炎等.該文從三葉青的人工栽培、離體快速繁殖和細胞培養(yǎng)、藥用活性成分分析等方面，綜述了生物技術應用于三葉青中的研究進展，并對今后研究方向進行了展望.

三葉青；生物技術；應用；進展

三葉青，又稱為金線吊葫蘆或金絲吊葫蘆，學名三葉崖爬藤（TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg），為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬植物，是一種極其珍稀的中草藥，全草皆有藥用價值，其中地下塊根和果實的藥用效果最好，曬干或鮮用［1－2］.

三葉青的藥用價值最早見于《本草綱目》，稱“三葉崖爬藤，性味苦、辛、涼，清熱解毒、活血祛風”.現(xiàn)代醫(yī)學研究證實，三葉青對于高熱、肺炎、肝炎、胃炎、子宮頸炎、淋巴結核、敗血癥等嚴重感染性疾病均有明顯療效［3］；特別是三葉青的提取物三葉青黃酮、β－谷甾醇、多糖等能有效抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，具良好的抗腫瘤作用［4－10］，且無毒副作用［11］.目前三葉青的提取物已經在臨床上用于抗癌、抗艾滋病毒，治療血液病、心腦血管疾病、肝炎、病毒性腦膜炎等［12］.然而，三葉青對生長環(huán)境要求非常奇特，它需生長在海拔700m的深山密林和懸崖峭壁的背陰面，上面要有散射光，旁邊要有細水滲出，下面要有樹葉覆蓋，氣溫保持在18℃左右才有利于其生長，現(xiàn)僅在浙江、廣西、江西等山區(qū)有少量的自然分布；并且在自然條件下生長速度緩慢.由于三葉青對生長環(huán)境要求苛刻，加上無節(jié)制的人為采挖，在自然條件下已瀕臨滅絕；而現(xiàn)代生物技術，尤其是細胞工程和基因工程技術，對三葉青的保護和利用具有重要的意義.目前有關生物技術在三葉青應用研究主要集中在如下幾個方面.

1 三葉青的人工栽培、離體快速繁殖和細胞培養(yǎng)

由于三葉青在自然條件下逐漸稀少，為此，人們試圖通過各種生物技術來達到繁殖和保護三葉青的目的.牟豪杰和董愛蘭采用人工種植的方法，選擇海拔為200～800m、土壤顆粒度為2～5mm的山地背陰面，將野生三葉青枝條剪成帶有2～3個節(jié)的莖段扦插于開耕好的壟上，并覆蓋5cm厚的稻草，每年的6～8月份搭建遮蔭棚，則第3年即可對三葉青地下塊根進行采掘［13］.浦錦寶等通過利用500mg/L的生根粉溶液浸泡插穗的下切口，移栽15d后施用鈣肥，也實現(xiàn)了人工繁育三葉青的目的［14］.吉慶勇等研究發(fā)現(xiàn)利用1 000mg/L IBA浸漬三葉青2～3年生老枝插條10s后，扦插于黃土中生根效果最佳；而基質對插穗生根的影響不明顯［15］.此外，劉杰書等報道對野生的三葉青進行分株后，采取防腐、適當遮光、合理澆水、病蟲防治等人工馴化的措施，以利于三葉青的人工栽培與養(yǎng)護［16］.

在組織培養(yǎng)快繁方面，錢麗華首次報道利用莖段的腋芽和試管不定芽作為起始外植體，通過叢生芽分化途徑實現(xiàn)了三葉青的離體快速繁殖［17－18］.徐剛等發(fā)明了一種組織培養(yǎng)快速繁殖三葉青的方法，在試管內可以快速大量繁殖三葉青組培苗，月增殖率達3～5倍，年組培苗生產能力每平方米培養(yǎng)室面積可達1萬苗以上［19］.姜維梅等也報道發(fā)明了一種三葉青的組培快速繁殖方法，通過對外植體的選取與處理、誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽等步驟實現(xiàn)了三葉青的快速繁殖［20］.鐘毓倩利用莖尖、帶腋芽的莖段和葉作為外植體，研究發(fā)現(xiàn)最佳誘導外植體為莖尖，誘導不定芽的培養(yǎng)基配方以MS＋2mg/L6－BA＋0.2mg/L NAA為最佳，而生根培養(yǎng)基以1/2MS＋0.5mg/L IBA＋1mg/L NAA為最佳［21］.值得一提的是，盧愛芳等以無菌苗葉片、野生三葉青葉片和莖段為外植體，誘導獲得愈傷組織，探究用組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織來快速生產三葉青黃酮的可行性；他們的研究結果發(fā)現(xiàn)，三葉青愈傷組織的最佳誘導培養(yǎng)基為2/3MS＋2.0mg/L 6－BA＋2.0mg/L NAA，最佳增殖培養(yǎng)基為MS＋2.0mg/L 6－BA＋2.0mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS＋1.0mg/L 6－BA＋1.0mg/L NAA；分析結果顯示：三葉青總黃酮含量在塊根中為31.135mg/g，在葉片中為12.830mg/g，在愈傷組織中高達18.047mg/g［22］.本課題組利用組織培養(yǎng)技術獲得了三葉青愈傷組織和再生小植株（圖1A和B），并利用發(fā)根農桿菌侵染三葉青外植體，成功誘導出毛狀根（圖1C）（待發(fā)表），這為利用毛狀根快速生產三葉青藥用活性成分奠定了技術基礎.

圖1 三葉青組織培養(yǎng)獲得的愈傷組織、小植株及發(fā)根農桿菌侵染誘導出的毛狀根Fig.1 Callus and plantlet of Tetrastigmahemsleyanumvia tissue culture and hairy root of Tetrastigmahemsleyanuminduced by Agrobacteriumrhizogenes

上述研究中，人工栽培主要采用扦插和分株的方式；離體快速繁殖主要通過調整細胞分裂素6－BA和生長素NAA或IBA的激素濃度，實現(xiàn)了植株的再生和快速繁殖.

2 三葉青的生理生化分析和DNA指紋分析

有學者利用生理生化分析技術和DNA標記指紋技術等研究了生態(tài)環(huán)境等外部條件對三葉青生長的影響.錢麗華等研究了溫度對三葉青鮮重、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白等生理指標的影響；試驗結果表明：30～35℃為三葉青試管組培苗最適宜生長溫度，一個月后每克平均鮮重增加達到4.402 7～5.149 3g；在該溫度下，其SOD酶活性增強、MDA含量偏低、膜修復能力增強、可溶性蛋白含量增加；而40℃以上高溫或10℃以下低溫則不利于三葉青試管組培苗的生長［23］.Dai Y等研究了光照對三葉青的光合效率、葉綠素熒光和葉綠素含量的影響，結果顯示：光照輻射抑制三葉青的光合同化過程，而大約67%的遮蔭條件最適合三葉青的栽培生長［24］.

袁帶秀研究發(fā)現(xiàn)，不同產地的三葉青酯酶同工酶和過氧化同工酶存在差異［25－26］.黃真等從性狀特征、顯微特征及一般理化鑒別等方面對浙江和廣西兩種不同產地三葉青進行生藥學鑒別，結果表明：浙江三葉青與廣西三葉青的大小、表面、斷面顏色及特征皆有不同，浙江三葉青水浸液粘性十足，而廣西三葉青水浸液不明顯；并且兩者導管排列方式有明顯的不同［27］.符淵淼利用DNA指紋技術對不同產地的三葉青進行了種質鑒定，DNA條形碼特征分析顯示，rbcL、matK、trnH－psbA、ITS的變異位點數分別為18、39、64和236，平均種間遺傳距離分別為0.006 3、0.004 9、0.018 4和0.074 5，平均種內遺傳距離分別為0.000 1、0.000 2、0.000 6和0.003 6；rbcL、matK、trnH－psbA、ITS分別可以鑒定22.2%、61.1%、66.7%和93.8%的不同產地的種群；三葉青可以被ITS或多片段條形碼準確鑒定［28］.

3 三葉青的藥用活性成分分析

三葉青的提取物中含有多種藥用活性成分.生物技術，尤其是色譜分析技術在分析三葉青藥用成分的種類和含量中發(fā)揮著重要作用.楊大堅等從三葉青塊根的氯仿提取物中分離得到3個化合物：6′－O－苯甲?；}卜苷、胡蘿卜苷和β－谷甾醇［29］.劉東和楊峻山采用溶劑提取和硅膠柱層析法對三葉青藥用成分進行分離，根據化合物的理化性質和光譜數據鑒定，從石油醚萃取物中分離得到4個化合物：蒲公英萜酮、蒲公英萜醇、β－谷甾醇和麥角甾醇［30］.劉東等報道從三葉青中分離得到9個化合物：α－香樹脂醇、三十二酸、水楊酸、丁二酸、胡蘿卜苷、山奈酚－7－O－β－L－吡喃鼠李糖－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、沒食子酸乙酯、甘露醇和環(huán)四谷氨肽［31］.Liu D等報道從三葉青中得到1種新的黃酮碳苷［32］.李瑛琦等從三葉青塊根的醋酸乙酯萃取物中分離得到7個化合物，經過鑒定，結構明確的有4個：β－谷甾醇、山奈酚、槲皮素和山奈酚－3－O－新橙皮糖苷［33］.霍昕等在三葉青塊根乙醚提取物中共分離出21個化合物，檢測出18個組分，其中含量較高的是亞油酸、棕櫚酸、油酸、二苯胺、亞麻酸甲酯和硬脂酸［34］.

另外，有學者探討了對三葉青藥用成分進行測定和分離的方法.毛一亮等利用正交試驗法，以總黃酮含量為考察指標，優(yōu)化三葉青中總黃酮的提取工藝，結果顯示：最佳提取工藝為1∶15倍煎藥液得量、回流提取2次、每次3h［35］.鄭軍獻等利用紫外可見分光光度法測定了三葉青中總黃酮的含量［36］.周國惠和黃建城建立了HPLC同時測定三葉青中的槲皮素和山奈酚的方法［37］.陳科敏等采用超聲處理，以乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數為考察因素，用分光光度法測定總黃酮含量，正交試驗結果顯示最佳超聲提取工藝為：12倍量的50%乙醇、超聲提取3次、每次1.5h［38］.張立明等以乙醇溶液為提取溶劑，采用響應面設計方法，對影響總黃酮提取效果的3個因素（乙醇濃度、液料比和提取時間）進行中心組合設計試驗，并建立數學模型，獲得了以乙醇作為溶劑提取三葉青中總黃酮的最佳工藝方法［39］.劉江波等選擇了10種國產大孔樹脂，以三葉青總黃酮的吸附量和解吸率為指標，經HPD826大孔樹脂一次純化后的產物中，三葉青總黃酮含量提高了2.44倍，HPD826大孔樹脂能較好地用于分離純化三葉青總黃酮［40］.浦錦寶等利用高效液相色譜法建立了三葉青中槲皮素、山奈酚含量的測定方法.槲皮素、山奈酚的加樣回收率分別為100.58%、99.35%，可用于三葉青藥材中槲皮素、山奈酚的含量測定，并評價藥材的質量優(yōu)劣［41］.

4 展 望

目前，三葉青的人工栽培、組織培養(yǎng)快速繁殖都取得了成功，但對這些人工快繁后代所含有的藥用成分含量尚缺少系統(tǒng)的研究，是否達到自然條件下生長的水平還有待分析.此外，三葉青作為野生藥用植物資源，不同產地的生態(tài)環(huán)境等因素對其藥用品質的影響、其細胞遺傳學特征、遺傳圖譜的構建尚未開展研究.另一方面，雖然利用氣相色譜技術對三葉青藥用活性成分進行了分析，但尚不清楚其究竟含有多少種藥用活性成分，這些活性成分的化學結構組成如何；特別是三葉青藥用活性成分合成途徑的關鍵酶和功能基因的研究未見任何報道.上述領域都有待在今后深入開展研究.

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Biotechnology Application in Herbal PlantTetrastigma HemsleyanumDielsEtGilg

DU Su－rui，XIANG Tai－h(huán)e，LI Meng

（College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg is one kind of rare and precious herbal plant，the extractives of which include flavanone，β－sitosterol，polysaccharide and so on.It has excellent anti－tumor function and has already been clinically used in the treatments of cancer，HIV，nosohemia，cardia－cerebrovascular disease，hepatitis and viral meningitis.This paper reviewed the research progress of biotechnology application inTetrastigmahemsleyanumDielsetGilg from the aspects of manual cultivations，rapid propagation and cell culture as well as medical bioactive ingredients analysis，and looked forward to the direction of further studies.

TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg；biotechnology；application；progress

Q943

A

1674－232X（2012）02－0142－04

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.02.010

2011－09－11

杭州市科技發(fā)展計劃項目（20110232B10）.

向太和（1965—），男，教授，博士，主要從事植物基因工程研究.E－mail：xthcn＠163.com