鄒 豐， 王緒明， 劉麗江△

(1江漢大學醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，湖北 武漢430056;2武漢大學基礎醫(yī)學院，湖北 武漢430071)

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。流行病學發(fā)現(xiàn)，男性胃癌的人數明顯多于女性胃癌，女性胃癌的發(fā)生時間要比男性晚10 ～15 年，且絕經期后發(fā)病率與男性基本相同，提示胃癌的發(fā)生與雌激素及其受體(estrogen receptor，ER)的作用有關［1］。ER 至少包括在細胞核或細胞膜表達的α 和β 2 個亞型。其中ER-α 除了參與細胞增殖、分化和凋亡外，也在冠心病及某些惡性腫瘤(如乳腺癌、結腸癌等)的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體ER -α66 的同源異構體ER -α36 介導胃癌的生長［3］，其機制并不清楚。

MicroRNA 是近幾年被證明的一類高度保守的內源性非蛋白編碼的小分子單鏈RNA，長度約為20 ～25 nt。MicroRNA 的主要功能是通過對靶基因轉錄體的切割或對其翻譯抑制來調控基因的表達［4］。有文獻報道m(xù)iR -143 在胃癌組織中的表達明顯下調［5］，miR-143 與結腸癌的侵襲轉移密切相關［6］。miR -143 與ER-α36 是否介導了胃癌的侵襲及其可能的機制并無文獻報告，本項研究旨在探討這一點。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞 人胃癌細胞系SGC7901 由武漢科技大學同濟醫(yī)學院免疫學系惠贈，為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 17β -雌二醇(17β -estradiol，E2)和TRIzol 購自Sigma;ER -α36 沉默質粒、ER -α36過表達質粒和ER - α36 單克隆抗體均由美國Creighton 大學醫(yī)學院癌癥中心王兆一教授饋贈;actin 抗體購自Santa Cruz;Transwell 侵襲試劑盒購自Millipore;miR-143、內參照U6 的Taqman 引物和探針均購自Applied Biosystems。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) SGC7901 細胞接種在含10%小牛血清的RPMI -1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 ～3 d 待細胞增長至約70 ～80%左右融合時胰酶消化傳代。E2分為低濃度(1 ×10-10mol/L)和高濃度(5 ×10-6mol/L)組，處理細胞的時間為12 h。

2.2 Transwell 侵襲實驗 SGC7901 細胞的侵襲實驗采用試劑盒的方法:向侵襲小室(Transwell chamber)中加入制備好的密度為(0.5 ～1.0)×109/L 的無血清細胞懸液。將小室置于含10%胎牛血清培養(yǎng)基的24 孔板內培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕刮除小室內未侵襲的細胞后，將小室底部置于試劑盒中的染色液里染色20 min。漂洗數次、風干。在顯微鏡下觀察，細胞計數。

2.3 構建穩(wěn)定轉染低表達ER-α36 和高表達ERα36 的SGC7901 細胞系 按照王兆一教授提供的ER-α36 有效靶序列設計合成單鏈寡聚DNA 重組慢病毒ER -α36 沉默質粒(pLKO.1 - PURO - SP6-ER-α36 -L)和ER -α36 過表達質粒(pLJM1 -ER-α36 - H)。ER - α36 上游引物5'- CCGGTTGATGCCAATAGGTACTGAACTCGAGTTCAGTACCTATTGGCATCAATTTTTTG - 3'，下 游 引 物5' - AATTCAAAAAATTGATGCCAATAGGTACTGAACTCGAGTTCAGTACCTATTGGCATCAA-3'。經單鏈退火反應后獲得雙鏈寡聚物。將雙鏈寡聚物連接到pLKO.1-PURO-SP6 載體(Age I/EcoR I)上，轉化至大腸桿菌E.coli XL-blue 感受態(tài)細胞，挑取6 個單克隆進行PCR 鑒定。1%凝膠電泳檢測，300 bp 條帶為陽性克隆，2 kb 條帶為陰性克隆。選取陽性克隆用Tiangen 小量抽提試劑盒抽提質粒，送上海英駿生物技術有限公司測序，U6 的引物為5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG -3'。接著構建穩(wěn)定轉染細胞系:以Lipofectamine 2000TM細胞轉染試劑盒將pLKO.1-PURO-SP6 - ER-α36 -L 和pLJM1 - ER-α36-H 轉染給包裝細胞293T 細胞，收集293T 細胞的病毒懸液并感染SGC7901 細胞，SGC7901 細胞長滿后按1∶10傳代，用嘌呤霉素篩選，最終得到pLKO.1-PURO-SP6 -ER -α36 -L(ER -α36 low group)和pLJM1 - ER-α36 -H(ER-α36 high group)的穩(wěn)定細胞株。同時建立空載體轉染SGC7901 細胞系pLKO.1 -PURO -scrambled shRNA(ER - α36 control group)。Western blotting 鑒定重組細胞ER-α36的表達。

2.4 Western blotting 檢測 提取細胞胞漿總蛋白，按BCA 蛋白含量測定試劑盒說明進行蛋白定量，SDS-PAGE 后蛋白半干轉印于PVDF 膜，封閉后I抗分開孵育:分別加入ER-α36 抗體和actin 抗體，4℃過夜;洗膜后孵育II 抗，室溫1 h，洗膜后于暗室中行ECL 顯色檢測蛋白的表達，采用數碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描測定ER-α36 和內參照actin 的表達(用平均吸光度值表示)。

2.5 MicroRNA 測序 2 株SGC7901 重組細胞系(ER-α36 low group 和ER-α36 high group)和對照組SGC7901 系(ER -α36 control group)送至深圳華大基因研究院進行microRNA 測序。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 高濃度、低濃度E2 對SGC7901 細胞侵襲性和ER－α36 表達的影響

與對照組SGC7901 細胞(7901 control)相比，高濃度E2刺激下的SGC7901 細胞(7901 +low E2)的侵襲性明顯減弱，而低濃度E2刺激下的SGC7901 細胞(7901 + high E2)的侵襲性明顯增強，見圖1。Western blotting 結果顯示，高濃度E2刺激SGC7901細胞后，ER - α36 的蛋白表達要明顯低于對照組SGC7901 細胞組，但這種效應在低濃度E2刺激后則為相反，見圖2。

2 穩(wěn)定轉染低表達ER－α36 和高表達ER－α36 的SGC7901 細胞系的構建

對構建好的2 株重組細胞系進行Western blotting 檢測結果顯示，高表達ER -α36 的SGC7901 細胞組(ER-α36 high)，其ER -α36 蛋白表達要明顯高于對照的SGC7901 細胞組(ER -α36 control)，低表達ER-α36 的SGC7901 細胞組(ER-α36 low)的ER-α36 蛋白表達要明顯低于對照組SGC7901 細胞組(ER-α36 control)，提示重組細胞系構建成功，見圖3。

Figure 1. The changes of the invasion ability of SGC7901 cells treated with high or low concentration of 17β-estradiol (×10).圖1 低濃度、高濃度E2 刺激胃癌SGC7901 細胞后侵襲能力的變化

Figure 2. The expression of ER-α36 in SGC7901 cells treated with high or low concentration of 17β-estradiol. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs 7901 control group.圖2 高濃度、低濃度E2 刺激胃癌SGC7901 細胞后ER－α36 蛋白的表達

Figure 3. The SGC7901 cells with stable low expression and high expression of ER-α36 were successfully constructed. ±s.n=5.* P ＜0.05 vs ER-α36 control group.圖3 低表達ER－α36 和高表達ER－α36 的SGC7901 胃癌細胞株構建成功

3 ER－α36 對SGC7901 細胞侵襲的影響

與普通SGC7901 細胞組(ER - α36 control)相比，高表達ER -α36 的SGC7901 細胞組(ER -α36 high)侵襲細胞數量明顯增多，而低表達ER-α36 的SGC7901 細胞組(ER -α36 low)侵襲細胞數量明顯減少，見圖4。這提示ER -α36 的表達與腫瘤的侵襲呈正相關。

Figure 4. The changes of the invasion ability of SGC7901 cells with stable low expression and high expression of ER-α36 (×10).圖4 低表達ER－α36 和高表達ER－α36 的胃癌SGC7901 細胞侵襲能力的變化

4 miR－143 表達與ER－α36 表達的關系

與普通SGC7901 細胞(ER -α36 control group)相比，高表達ER -α36 的SGC7901 細胞(ER -α36 high group)miR -143 表達顯著下調，低表達ER -α36 的SGC7901 細胞(ER - α36 low group)miR -143 表達則顯著上調，見圖5。

Figure 5. The expression of miR-143 was significantly decreased in the SGC7901 cells with stable high expression of ER-α36 and was increased in the SGC7901 cells with stable low expression of ER-α36. ＊＊P ＜0.01 vs ER-α36 control group.圖5 miR－143 在不同ER－α36 表達的胃癌細胞系中的表達

討 論

ER 在胃癌中的作用機制研究可以追溯到上個世紀，但一直未取得突破性的進展。1986 年首次發(fā)現(xiàn)ER 在胃癌細胞中表達，其陽性率約50%，尤以ER - α66 的陽性表達受到重視［7］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，ER - α 至少包括ER - α66、ER - α46 和ER -α36［8］，其中ER-α46 和ER -α36 的主要功能作用并不清楚。但有研究證實，ER -α36 的表達不完全依賴于ER-α66，并可經細胞膜啟動雌激素類信號轉導［9-10］。

我們的前期研究工作發(fā)現(xiàn):人胃癌細胞系(BGC-823、AGS、MKN -45 和SGC -7901)均能在mRNA、蛋白質及細胞內定位的不同層面表達ER -α36蛋白，并且對雌激素、選擇性雌激素受體調節(jié)劑(tamoxifen)以及雌激素受體特異性阻斷劑(ICI 182780)產生應答;ER-α36 蛋白在人體胃癌組織中也呈高表達［3］。本研究通過用高劑量或低劑量的17β-雌二醇刺激SGC7901 人胃癌細胞，以模擬絕經前女性或男性的雌激素環(huán)境，結果發(fā)現(xiàn)低劑量的17β-雌二醇可以增加ER - α36 蛋白的表達，增強SGC7901 細胞的侵襲能力，而高劑量的17β-雌二醇刺激細胞后的效應相反。因此，為解釋絕經前女性的胃癌發(fā)病率明顯低于男性的臨床現(xiàn)象提供了一定的實驗證據，也為從理論上闡述高雌激素的保護作用提供了支持，而高雌激素的保護主要是通過ER -α36 介導的，并且與胃癌的生長和侵襲密切相關。

現(xiàn)階段大量文獻報道，microRNA 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的功能大概類似于癌基因或抑癌基因，幾乎參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的每一步過程，因此在腫瘤診斷、治療等方面具有很好的應用前景［11］。miR -143 位于人類基因組5 號染色體上，現(xiàn)階段已證實與多種腫瘤存在聯(lián)系。miR -143 在不同腫瘤中表達并不完全一致:在肝癌中高表達［12］，在結腸癌或肺癌中低表達［13-14］，并且與結腸癌轉移相關基因1 以及結腸癌的侵襲轉移密切相關［6］。有研究顯示，miR-143 在胃癌組織中的表達明顯下調，并在區(qū)分胃癌的分化度方面有較好的敏感性和特異性［5］。但與胃癌轉移的關系如何，未見報道。我們通過測序的方法發(fā)現(xiàn)，與ER-α36 表達密切相關的microRNA 是miR-143，即高表達ER -α36 的SGC7901 細胞miR -143 表達顯著下調，而低表達ER -α36 的SGC7901細胞miR -143 表達顯著上調。因此，我們推測ER-α36 介導胃癌的侵襲有可能受到miR -143 的調控。但miR-143 調控ER -α36 的表達以及還有哪些相關靶基因參與胃癌侵襲的過程，還需進一步研究證實。

綜上所述，本研究結果顯示:低濃度的雌激素促進胃癌細胞的侵襲，高濃度的雌激素抑制胃癌細胞的侵襲。胃癌的侵襲能力和雌激素受體ER - α36的表達呈正相關，其機制可能與miR-143 的調控有關。

［1］ Sipponen P，Correa P. Delayed rise in incidence of gastric Cancer in females results in unique sex ratio (M/F)pattern:etiologic hypothesis［J］. Gastric Cancer，2002，5(4):213 –219.

［2］ Pedram A，Razandi M，Levin ER. Nature of functional estrogen receptors at the plasma membrane［J］. Mol Endocrinol，2006，20(9):1996 -2009.

［3］ Deng H，Huang X，F(xiàn)an J，et al. A variant of estrogen receptor，ER - α36 is expressed in human gastric cancer and is highly correlated with lymph node metastasis［J］.Oncol Rep，2010，24(1):171 -176.

［4］ Lee Y，Kim M，Han J，et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II［J］. EMBO J，2004，23(20):4051 -4060.

［5］ 林巧愛，李玲玲，鞏文辭，等. miR-143 在胃癌中的表達及其臨床病理意義［J］. 中國病理生理雜志，2010，26(9):1674 -1678.

［6］ Zhang Y，Wang Z，Chen M，et al. MicroRNA-143 targets MACC1 to inhibit cell invasion and migration in colorectal cancer［J］. Mol Cancer，2012，11:23.

［7］ Tokunaga A，Nishi K，Matsukura N，et al. Estrogen and progesterone receptors in gastric cancer ［J］. Cancer，1986，57(7):1376 -1379.

［8］ Karat D，Brotherick I，Shenton BK，et al. Expression of oestrogen and progesterone receptors in gastric cancer:a flow cytometric study［J］. Br J Cancer，1999，80(8):1271 -1274.

［9］ Wang Z，Zhang X，Shen P，et al. Identification，cloning，and expression of human estrogen receptor -α36，a novel variant of human estrogen receptor - α66［J］. Biochem Biophys Res Commun，2005，336(4):1023 -1027.

［10］ Wang Z，Zhang X，Shen P，et al. A variant of estrogen receptor-α，hER -α36:transduction of estrogen - and antiestrogen - dependent membrane - initiated mitogenic signaling［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(24):9063 -9068.

［11］ Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al. A microRNA expression signature of human solid tumor defines cancer gene target［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(7):2257 -2261.

［12］ Zhang X，Liu S，Hu T，et al. Up -regulated microRNA-143 transcribed by nuclear factor kappa B enhances hepatocarcinoma metastasis by repressing fibronectin expression［J］. Hepatology，2009，50(2):490 -499.

［13］ Kulda V，Pesta M，Topolcan O，et al. Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases［J］. Cancer Genet Cytogenet，2010，200(2):154 -160.

［14］ Gao W，Yu Y，Cao H，et al. Deregulated expression of miR-21，miR -143 and miR -181a in non small cell lung cancer is related to clinicopathologic characteristics or patient prognosis［J］. Biomed Pharmacother，2010，64(6):399 -408.