HPLC-ESI-MS/MS 分析姜黃中姜黃素類化合物

蔣建蘭 ，靳曉麗，喬 斌，元英進(jìn)

系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市生物與制藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津300072

姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖，被廣泛用于食品調(diào)料、著色劑以及中藥，藥理研究表明具有抗腫瘤、消炎、抗氧化、抗艾滋病、抗老年癡呆、降血脂等作用［1-3］。1985 年Kuttan 等［4］首次提出姜黃與姜黃素具有抗腫瘤活性。此后，有關(guān)這方面研究逐漸成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。其中姜黃素已被美國國家癌癥研究所(NCI)列為第三代防癌藥物［5］。姜黃主要抗腫瘤活性成分為姜黃素類化合物［6-8］。其中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素是最常見的3 種化合物，此外，姜黃屬植物中還含有許多微量的姜黃素類化合物，許多研究表明這些微量成分與3 個常見成分有著相似甚至更好的藥理活性［9-13］。現(xiàn)已從姜黃中發(fā)現(xiàn)了28種姜黃素類化合物，吳宏偉等［14］將這28 種化合物歸納為12 種母核和4 種取代基的組合。

目前，許多檢測方法都已用于姜黃素類化合物研究，主要有液質(zhì)聯(lián)用［15-21］、薄層色譜［22，23］、毛細(xì)管電泳［24］等，大多研究主要分析姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素3 種常見化合物，少有文獻(xiàn)報道分析其它微量姜黃素類化合物。李偉等［15］利用ESI 離子源，正離子模式掃描，在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下對目標(biāo)成分進(jìn)行定性分析，建立了HPLCESI-MS/MS 分析方法。利用質(zhì)譜碎裂規(guī)律，分別對每個目標(biāo)成分同時監(jiān)測8 個母離子/特征子離子對的反應(yīng)過程，從姜黃中檢測出6 種姜黃素類化合物。Hongliang Jiang 等［20］用ESI 離子源，正負(fù)兩種掃描模式，結(jié)合DAD 檢測模式，建立了姜黃LC-ESI-MS/MS 分析方法，共檢測出19 種姜黃素類化合物。

本文通過色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，利用HPLCESI-MS-MS 方法從姜黃中同時檢出28 種姜黃素類化合物(見表1)，其中20 種化合物與文獻(xiàn)報道一致［9，10，15，20］，另外8 種化合物筆者尚未見從姜黃中報道，并解析了它們的二級質(zhì)譜斷裂規(guī)律。本文為更加全面研究姜黃中姜黃素類化合物提供參考。

表1 姜黃中鑒別出的姜黃素類化合物Table 1 Curcuminoids identified in Curcuma longa L.

母核和取代基Mother nuclears and substituents

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國熱電集團(tuán)Finnigan Surveyor 液相系統(tǒng);Finnigan 離子阱質(zhì)譜儀，型號為LCQ Deca XP MAX;

乙腈(色譜純，美國Merck 公司)，甲醇(色譜純，美國Merck 公司)，甲酸(美國fluka)，Millipore超純水。

姜黃素(20100318)、去甲氧基姜黃素(20100318)、雙去甲氧基姜黃素(20100318)對照品購于鼎瑞化工(上海)有限公司;

姜黃根莖(20100301)購于河北安國，由天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖。

1.2 對照品溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對照品，用甲醇溶解并定容至10 mL 的容量瓶中，于4 ℃下保存待用。

1.3 色譜條件

色譜柱:Venusil XBP C18(2. 1 ×150mm，5μm，Agela Technologies)。流動相:A 相為水(0. 1% 甲酸)，B 相為乙腈(0.1%甲酸)。梯度洗脫條件:0～2 min，10%B-10%B;2～57 min，10%B-100%B;57～60 min，100%B-100%B。柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.2 mL/min。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI);正負(fù)離子同時掃描;Full Scan;噴霧電壓4.5 kV;毛細(xì)管溫度350 ℃;吹掃氣壓力10 arb;輔助氣流速40 arb;質(zhì)量掃描范圍:正離子為m/z 100～1000，負(fù)離子為m/z 150～1000;二級質(zhì)譜碰撞能量(CID):35 eV。

1.5 樣品前處理

首先將姜黃粉碎，過40 目篩，準(zhǔn)確稱量約50 mg 的姜黃粉末置于1000 mL 具塞錐形瓶中，加入500 mL 無水甲醇，混勻，超聲萃取45 min，過濾并收集濾液，50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無液體蒸出，將剩余的稠狀液體轉(zhuǎn)移至離心管，15000 rpm 離心10 min，吸取離心后的稠狀液體約1 mL 并用甲醇定容于10 mL 棕色容量瓶，以0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液供分析。

圖1 負(fù)離子模式(a)和正離子模式(b)下的總離子流圖Fig.1 Total ion current (TIC)chromatograms from negative ion mode(a)and positive ion mode(b)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜分離條件的優(yōu)化

HPLC-ESI-MS-MS 具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、樣品前處理簡單的特點(diǎn)，是分析中藥、鑒定中藥復(fù)雜體系的首選方法。本文通過對比其他類型的色譜柱，最終采用通用型、非極性且具有廣泛pH 適用范圍(1.5～10.0)的Venusil XBP C18型色譜柱，它適用于各類非極性、極性化合物，穩(wěn)定性好，酸或堿性流動相下都有較好的使用壽命;采用常用流動相體系乙腈-水，因姜黃素類化合物含有酚羥基，易出現(xiàn)色譜峰拖尾，為了改善峰形，經(jīng)對比試驗(yàn)在流動相中添加0.1%甲酸效果最好。調(diào)節(jié)流動相洗脫程序確定了梯度條件，得到了優(yōu)化的色譜分離效果，正、負(fù)總離子流圖，見圖1。

圖2 姜黃素類化合物的正離子二級圖譜(左)和負(fù)離子二級圖譜(右)Fig.2 Positive ion (+)ESI/MS/MS (left)and negative ion (-)ESI/MS/MS (right)of curcuminoids

姜黃素類化合物大都含有酚羥基，在負(fù)離子模式下此類化合物比較容易電離，但對樣品中含量過低的化合物不夠敏感，而正離子模式對微量化合物靈敏度較高，特別是含有O 和N 原子的物質(zhì)更是易質(zhì)子化而被檢測出來［15］。本文以姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素作為目標(biāo)物質(zhì)，在正負(fù)離子兩種模式下進(jìn)行母離子全掃描，優(yōu)化毛細(xì)管溫度、噴霧電壓、吹掃氣壓力、鞘氣流速等參數(shù)，得到目標(biāo)物質(zhì)最強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰。然后對選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，在優(yōu)化的條件下得到目標(biāo)物質(zhì)的二級質(zhì)譜圖，其中筆者未見文獻(xiàn)報道的8 種化合物的二級質(zhì)譜圖見圖2。

2.2 姜黃素類化合物的質(zhì)譜解析

姜黃素類化合物在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為［M +H］+，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰主要是［M–H］–，除此還有少量的［M–H+HCOOH］–。采用提取離子流(EIC)方式找到了28 個明顯特征峰，根據(jù)譜峰的保留時間和質(zhì)譜一、二級離子碎片信息，并結(jié)合對照品及參考文獻(xiàn)信息，進(jìn)行色譜峰的化合物歸屬分析。姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素3 種物質(zhì)通過與對照品的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比確定，其它25 種化合物通過與這3 種常見姜黃素類化合物的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及二級斷裂方式的比較中推測鑒定。這28種化合物中有20 種與文獻(xiàn)報道一致［9，10，15，20］，包含雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素(化合物23、24 和25)。其它8 種物質(zhì)解析如下:

化合物2:3，5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羥基苯基)-庚烷。

(–)ESI-MS 檢測到準(zhǔn)分子離子［M – H］–為m/z 361，保留時間為17.23 min，觀察它的二級質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)碎片比較少，母離子很難被打碎，推測此種物質(zhì)缺少氧化性基團(tuán)而不易碎裂，從保留時間和二級質(zhì)譜碎片信息初步推斷與化合物1，7-bis(4-hydroxyphenyl)-3，5-heptanediol 為同一系列物質(zhì)(母核骨架為庚烷-3，5-二醇)［20］，分子量相差46，推測比文獻(xiàn)化合物多一個羥基和一個甲氧基，初步推斷為3，5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羥基苯基)-庚烷。分析二級質(zhì)譜圖，m/z 361 準(zhǔn)分子離子峰產(chǎn)生了m/z 179、165、223、209 共4 個主要二級碎片，在電噴霧電離過程中，羥基碳和臨碳之間容易斷裂，分別失去一個中性分子得到碎片m/z 179、165、223、209。根據(jù)裂解方式可以推測該化合物即為3，5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羥基苯基)-庚烷。該化合物含有較多羥基，對負(fù)離子檢測模式比較敏感(見圖2 和圖3)。

圖3 化合物2 在負(fù)離子模式下的二級碎片F(xiàn)ig.3 (-)ESI-MS/MS fragmentation of curcuminoid 2

化合物10:1-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯-3-酮。

(+)ESI-MS 檢測到準(zhǔn)分子離子［M + H］+為m/z 383，保留時間為22.32 min，初步推斷與化合物8 和9 為同一系列化合物(母核骨架為1，4，6-庚三烯-3-酮)，分子量比9 多30，即多一個甲氧基，初步推斷為1-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯-3-酮。分析二級質(zhì)譜圖，m/z 383 準(zhǔn)分子離子峰沒有產(chǎn)生碎片，在電噴霧電離過程中，因?yàn)榇嬖谌齻€雙鍵的共軛結(jié)構(gòu)，母離子很難被打碎，推測確實(shí)是同一系列物質(zhì)。

化合物11 和12:環(huán)雙去甲氧基姜黃素、環(huán)去甲氧基姜黃素。

檢測到準(zhǔn)分子離子峰［M + H］+分別為m/z 309、339;［M–H］–分別為m/z 307、337，保留時間分別為22.95 min 和23.31 min，二級碎片和雙去甲氧基姜黃素(23)、去甲氧基姜黃素(24)的二級圖譜幾乎相同，雖然保留時間不同，但二級斷裂方式基本一致，推測它們?yōu)橥之悩?gòu)體，已有文獻(xiàn)報道姜黃中存在環(huán)姜黃素［10］，它是姜黃素的同分異構(gòu)體，推測化合物13 為環(huán)姜黃素，故化合物11 和12 分別推測為環(huán)雙去甲氧基姜黃素、環(huán)去甲氧基姜黃素。

化合物15、16 和17:結(jié)構(gòu)暫未推斷。

檢測到準(zhǔn)分子離子峰［M + H］+分別為m/z 293、323、353，保留時間分別為26. 91 min、27. 61 min、28.16 min，二級碎片分別為m/z 199、225;m/z 229、255;m/z 259、285。分子量和二級碎片均相差30(一個甲氧基)，說明它們具有相同的斷裂方式，推測為同一系列化合物，目前還沒有推測出它們的具體結(jié)構(gòu)。雖然文獻(xiàn)中已有分子量為292 的姜黃素類化合物報道［25］，但它的結(jié)構(gòu)和化合物8、9 是同一系列。

化合物19:1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基苯基)-庚烷-3，5-二酮。

(-)ESI-MS 檢測到準(zhǔn)分子離子［M-H］–為m/z 341，保留時間為30.74 min，推斷與化合物18 為同一系列物質(zhì)(母核骨架為庚烷-3，5-二酮)，分子量相差30，推測比化合物18 多一個甲氧基，初步推斷為1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基苯基)-庚烷-3，5-二酮。分析二級質(zhì)譜圖，m/z 341 準(zhǔn)分子離子峰產(chǎn)生了m/z 205、235、219 共3 個主要二級碎片，在電噴霧電離過程中:(1)發(fā)生重排反應(yīng)，并失去一個中性分子，得到碎片m/z 205。(2)發(fā)生重排反應(yīng)，并失去一個中性分子，得到碎片m/z 235。(3)通過氫轉(zhuǎn)移失去一個中性分子，得到碎片m/z 219。根據(jù)裂解方式可以推測該化合物即為1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基苯基)-庚烷-3，5-二酮。因?yàn)楹康停?+)ESI-MS/MS 檢測沒有得到響應(yīng)(見圖2和4)。

圖4 化合物19 在負(fù)離子模式下的二級碎片F(xiàn)ig.4 (-)ESI-MS/MS fragmentation of curcuminoid 19

3 結(jié)論

本文應(yīng)用HPLC-ESI-MS-MS 的方法，根據(jù)譜峰信息，并結(jié)合對照品和參考文獻(xiàn)信息，同時檢測出28 種姜黃素類化合物，根據(jù)母核骨架結(jié)構(gòu)可以劃分為幾個系列，同一系列的化合物具有相同的斷裂方式。姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素這3 種物質(zhì)是通過與對照品對比鑒定的，以此為基礎(chǔ)推測出其它25 種化合物，并細(xì)致分析了未見從姜黃中報道的8 種化合物的二級質(zhì)譜碎裂規(guī)律。

由于姜黃中微量姜黃素類化合物的含量低，難以鑒別，而該方法比較明確的同時檢測出28 種化合物，且靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性良好，說明該方法可用于姜黃中姜黃素類化合物的檢測，本文為姜黃中姜黃素類化合物的更加全面研究提供了參考。

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