巴俊，于靖

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072)

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularition，CNV)又名視網(wǎng)膜下新生血管，是來(lái)自正常脈絡(luò)膜組織的增殖血管，可通過(guò)Bruch膜破損處進(jìn)入Bruch膜與視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)之間、視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與RPE之間、RPE與脈絡(luò)膜之間。CNV是許多脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性滲出期、高度近視黃斑變性等發(fā)生發(fā)展中的重要病理機(jī)制。為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這些疾病確切的發(fā)病機(jī)理，制作接近臨床特征的CNV動(dòng)物模型是必要的前提?，F(xiàn)對(duì)近年來(lái)的CNV動(dòng)物模型的制作進(jìn)展綜述如下。

1 激光誘導(dǎo)CNV模型

1.1 激光誘導(dǎo)CNV模型的機(jī)制

血管生成是正常組織生長(zhǎng)和修復(fù)的一種生理過(guò)程，整個(gè)過(guò)程受到維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的血管生成因子和抑制因子的嚴(yán)密調(diào)控。當(dāng)平衡遭到破壞，新生血管形成。人類(lèi)CNV疾病的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是已確定與一些血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)［1］、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)［2］、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)等有密切聯(lián)系。脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等可以釋放這些細(xì)胞因子［3-4］。激光誘導(dǎo)CNV模型和人類(lèi)CNV疾病產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)，都基于破壞RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體，打破血管生成因子和抑制因子的平衡，產(chǎn)生新生血管。新生血管中包含炎癥細(xì)胞、血管成分和細(xì)胞外基質(zhì)，CNV的產(chǎn)生均來(lái)源于脈絡(luò)膜血管。

與人類(lèi)CNV疾病的發(fā)生機(jī)制不同的是，激光是通過(guò)對(duì)視網(wǎng)膜產(chǎn)生機(jī)械損傷、熱效應(yīng)和光化學(xué)等生物效應(yīng)造成Bruch膜破壞，使視網(wǎng)膜在炎癥修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生新生血管［5］。人類(lèi)CNV疾病的發(fā)生包括炎癥反應(yīng)、血管生成和蛋白酶水解3個(gè)階段，它們之間相互作用共同促進(jìn)CNV的發(fā)生發(fā)展。在視網(wǎng)膜微環(huán)境發(fā)生改變的早期起始階段，RPE和光感受器產(chǎn)生VEGF［6］，趨化巨噬細(xì)胞集中至Bruch膜生成血管的部位［7］，產(chǎn)生蛋白水解酶作用破壞Bruch膜，誘發(fā)形成新生血管。

1.2 制作CNV模型的常用激光

目前用于制作CNV模型的激光主要有氪激光、氬激光、二極管激光、Q-開(kāi)關(guān)摻釹釔石榴石(neodymiumdoped yttrium aluminium garnet，Nd:YAG)激光等。激光波長(zhǎng)不同，穿透深度亦不同，這對(duì)視網(wǎng)膜損傷的作用部位有著重要影響。藍(lán)綠氬激光穿透力較弱，主要作用于視網(wǎng)膜內(nèi)層和RPE層。氪激光主要作用于RPE和脈絡(luò)膜內(nèi)層。1979年Ryan等［8］首次采用激光制作出CNV動(dòng)物模型，1998年Tobe等［9］將氪激光光凝術(shù)應(yīng)用于制作小鼠CNV模型，此后激光誘導(dǎo)CNV模型被普遍應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和治療方法的研究中。激光誘導(dǎo)CNV模型的優(yōu)點(diǎn)在于與人類(lèi)CNV疾病發(fā)生自然過(guò)程相似，但不同研究CNV模型成功率不同，與不同實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物類(lèi)型、激光種類(lèi)及對(duì)觀察診斷CNV的標(biāo)準(zhǔn)不一有關(guān)(表1)。

表1 激光誘導(dǎo)CNV實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的相關(guān)文獻(xiàn)

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.3.1 大鼠和小鼠 理想的動(dòng)物模型應(yīng)該有以下重要特征:(1)模型制作成功率高;(2)模型持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且穩(wěn)定;(3)病理學(xué)特征與人類(lèi)CNV疾病病理改變相似;(4)模型制作成本低;(5)模型眼與人眼大小相似，便于模型實(shí)驗(yàn)操作與檢查。激光誘導(dǎo)CNV的模型動(dòng)物有很多種類(lèi)，其中鼠類(lèi)模型的應(yīng)用最為廣泛。鼠類(lèi)模型優(yōu)點(diǎn)在于模型制作成功率較高，價(jià)格便宜，短時(shí)間(一般2～3周)即可觀察到結(jié)果。

與人類(lèi)的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相比，剛出生的幼鼠視網(wǎng)膜上即可見(jiàn)未發(fā)育成熟的透明血管，出生后的小鼠分支狀透明血管排列有序［13］，是研究生理性和病理性血管發(fā)生發(fā)展機(jī)制較理想的研究對(duì)象。大多數(shù)研究參與及影響CNV發(fā)生發(fā)展機(jī)制因素的實(shí)驗(yàn)是采用鼠類(lèi)模型［14-15］。Garcia等［11］用二極管激光光凝大鼠視網(wǎng)膜，并在激光光凝前后分別靜脈注射碘酸鈉破壞視網(wǎng)膜形態(tài)，結(jié)果證實(shí)RPE層完整性是CNV發(fā)生的決定性因素。Nakai等［16］通過(guò)研究激光誘導(dǎo)小鼠基因數(shù)量性狀位點(diǎn)，證實(shí)不同個(gè)體對(duì)細(xì)胞因子刺激生成新生血管的易感性不同。

1.3.2 兔 兔眼激光誘導(dǎo)模型在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較為廣泛，優(yōu)點(diǎn)在于兔眼較之鼠眼在大小上更接近人類(lèi)，易于模型實(shí)驗(yàn)操作與檢查;家兔來(lái)源廣泛，費(fèi)用較低，CNV出現(xiàn)時(shí)間早且穩(wěn)定(3～4周)。然而，兔眼視網(wǎng)膜解剖結(jié)構(gòu)與人類(lèi)不同，視網(wǎng)膜后極部相當(dāng)于人類(lèi)黃斑區(qū)，血管供應(yīng)少，熒光素滲漏特點(diǎn)不典型，但可以用組織學(xué)觀察結(jié)果作為CNV的判定標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究［12］用倍頻Nd:YAG 532 nm綠激光(功率800 mW，光斑直徑50 μm，曝光時(shí)間0.05 s)光凝色素兔視網(wǎng)膜，第3～4周見(jiàn)穩(wěn)定的滲漏光斑，CNV發(fā)生率66.7%，滲漏率51.7%。

1.3.3 猴 猴的視網(wǎng)膜及黃斑結(jié)構(gòu)與人類(lèi)相似，眼球大小便于操作，具有熒光滲漏的特點(diǎn)，是用于臨床藥物篩選的首選模型［17］。Ryan 等［8］利用氬激光(功率200～950 mW，光斑直徑50～200 μm，曝光時(shí)間0.1～0.5 s)光凝猴視網(wǎng)膜成功建立了CNV動(dòng)物模型，但相比鼠類(lèi)和家兔，CNV滲漏率較低(僅40%)，且猴來(lái)源少，費(fèi)用高，飼養(yǎng)較困難，模型制作需4周以上，因此應(yīng)用受限。

2 手術(shù)誘導(dǎo)CNV模型

2.1 視網(wǎng)膜下注射VEGF基因的腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體

載有VEGF的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)是較為理想的模型。由于炎癥反應(yīng)可能參與CNV的形成，需用類(lèi)固醇抑制激光光凝過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，但用注射針頭經(jīng)玻璃體腔破壞Bruch膜進(jìn)行視網(wǎng)膜下AAV注射可避免實(shí)驗(yàn)操作中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)［18］。其次，人腺病毒血清5型由于其致病性低，無(wú)論是在體內(nèi)或是體外的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)都是理想的載體。近年來(lái)，該方法多用于研究通過(guò)過(guò)表達(dá)VEGF誘導(dǎo)的 CNV模型制作。Wang等［18］將2 μl編碼人VEGF-A165腺病毒注射到大鼠視網(wǎng)膜下，CNV發(fā)生率為95%。Julien等［19］在兔眼視網(wǎng)膜下注射5×106IU載有過(guò)表達(dá)VEGF-A165腺病毒載體誘導(dǎo)CNV模型，CNV發(fā)生率為83%。此外，VEGF-B是VEGF另一種分泌肽，對(duì)它在眼內(nèi)的作用知之甚少。Zhong等［20］將攜帶VEGF-B AAV載體注射到玻璃體腔，發(fā)現(xiàn)VEGF-B過(guò)表達(dá)可促進(jìn)病理性視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管，且沒(méi)有因?qū)ruch膜-視網(wǎng)膜血管屏障的破壞造成炎癥。VEGF-B與糖尿病視網(wǎng)膜病變和年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)展密切相關(guān)，提示這些疾病的并發(fā)癥不依賴(lài)于炎癥反應(yīng)。

2.2 視網(wǎng)膜下注射基質(zhì)膠(Matrigel)

Matrigel是一種從 EHS腫瘤(engelbreth holm swarm tumor)中提取出可溶性基底膜基質(zhì)，其主要成分是層粘連蛋白、Ⅰ型膠原、肝素硫酸化黏蛋白以及一些在EHS腫瘤中自然表達(dá)的生長(zhǎng)因子，如bFGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)。Matrigel在4℃是液體，37℃時(shí)呈凝膠狀態(tài)。利用此種特性在視網(wǎng)膜下注射Matrigel，能有效控制生長(zhǎng)因子的緩慢釋放，制作持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的CNV動(dòng)物模型。Qiu等［21］在兔眼視網(wǎng)膜下注射Matrigel和VEGF，注射后1周眼底熒光血管造影即可在視網(wǎng)膜局部觀察到滲漏點(diǎn)，滲漏量在2～4周增加，大部分可持續(xù)9周。但Julien等［19］質(zhì)疑將凝膠狀Matrigel注射到視網(wǎng)膜下，會(huì)在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與脈絡(luò)膜組織之間形成物理屏障，有悖于滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性新生血管的發(fā)生機(jī)制。

2.3 脂質(zhì)過(guò)氧化氫物

脂質(zhì)過(guò)氧化氫物可以誘導(dǎo)血管生成因子產(chǎn)生CNV。隨著年齡增長(zhǎng)，人類(lèi)眼后極部容易受到氧化損傷產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化氫物。Tamai等［22］將不同劑量(5～200 μg)亞油酸過(guò)氧化氫物(linoleic acid hydroperoxide，LHP)注射在兔眼視網(wǎng)膜下，發(fā)現(xiàn)LHP劑量不同會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜會(huì)造成不同程度的損害。當(dāng)注射較小劑量(12.5～25 μg)時(shí)，CNV發(fā)生率為46%。而大劑量LHP(≥100 μg)會(huì)破壞視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞，但是不產(chǎn)生CNV。證實(shí)高濃度LHP有顯著毒性，可抑制RPE細(xì)胞吞噬LHP，并抑制其增殖產(chǎn)生血管生成因子。Framme 等［23］使用不同濃度 LPH(25 ng/50 ml和100 ng/50 ml)進(jìn)行兔眼視網(wǎng)膜下注射，結(jié)果顯示低濃度組沒(méi)有CNV形成，高濃度組CNV發(fā)生率低，僅為27%。組織學(xué)發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜外層破壞顯著，但脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層結(jié)構(gòu)完整。這提示高濃度的LPH對(duì)CNV的發(fā)生并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，與Tamai等［22］研究結(jié)果一致。Baba等［24］在大鼠視網(wǎng)膜下注射小劑量(30 ng·ml-1)LHP，獲得85.7%的成功率。同時(shí)，研究表明大劑量LHP對(duì)神經(jīng)元、RPE和內(nèi)皮細(xì)胞具有毒性，而小劑量可以促進(jìn)增殖血管形成。小劑量視網(wǎng)膜下注射LHP在體內(nèi)無(wú)毒性，且能保持視網(wǎng)膜組織完整性，新生血管發(fā)生過(guò)程接近人類(lèi)CNV疾病的發(fā)生發(fā)展，是研究AMD發(fā)生發(fā)展機(jī)制，后續(xù)評(píng)估光動(dòng)力學(xué)療法或抗VEGF治療的理想模型。

3 小 結(jié)

目前，CNV的動(dòng)物模型建立主要是通過(guò)破壞Bruch膜或產(chǎn)生過(guò)量生長(zhǎng)因子，各有優(yōu)缺點(diǎn)，尚沒(méi)有能夠完全模擬人CNV發(fā)生發(fā)展的最為理想的模型。由于不同模型建立的基礎(chǔ)和特點(diǎn)不同，CNV成功率和持續(xù)時(shí)間也不同，可將不同制作方法應(yīng)用于不同方面的研究。

［1］侯瑋瑋，蔣犁，喬立興.色素內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、色素上皮衍生因子在酸中毒誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病大鼠動(dòng)物模型中的表達(dá)［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2009，37(1):1-7.

［2］艾靜，劉瑤，欒潔，等.糖基化終產(chǎn)物對(duì)視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2008，36(2):107-110.

［3］KAMISASANUKI T，TOKUSHIQE S，TERASAKI H，et al.TargetingCD9 producesstimulus-independentantiangiogenic effects predominantly in activated endothelial cells during angiogenesis:a novel antiangiogenic therapy［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，413(1):128-135.

［4］LOPEZ P F，SIPPY B D，LAMBERT H M，et al.Transdifferentiated retinal pigment epithelial cells are immunoreactive for vascular endothelial growth factor in surgically excised age-related macular degeneration-related choroidal neovascular membranes［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1996，37(5):855-868.

［5］CHAPPELOW A V，TAN K，WAHEED N K，et al.Panretinal photocoagulation for proliferative diabetic retinopathy:pattern scan laser versus argon laser［J］.Am J Opthalmol，2012，153(1):137-142.

［6］NAGINENI C N，KOMMINENI V K，WILLIAM A，et al.Regulation of VEGF expression in human retinal cells by cytokines:implications for the role of inflammation in age-related macular degeneration［J］.J Cell Physiol，2012，227(1):116-126.

［7］GROSSNIKLAUS H E，LING J X，WALLACE T M，et al.Macrophage and retinal pigment epithelium expression of angiogenic cytokines in choroidal neovascularization［J］.Mol Vis，2002，8:119-126.

［8］RYAN S J.The development of an experimental model of subretinal neovascularization in disciform macular degeneration［J］.Trans Am Ophthalmol Soc，1979，77:707-745.

［9］TOBE T，ORTEGA S，LUNA J D，et al.Targeted disruption of the FGF2 gene does not prevent choroidal neovascularization in a murine model［J］.Am J Pathol，1998，153(5):1641-1646.

［10］DOBI E T，PULIAFITO C A，DESTRO M.A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat［J］.Arch Ophthalmol，1989，107:264-269.

［11］ GARCIA-LAYANA A，VASQUEZ G，SALINAS-ALAMAN A，et al.Development of laser-induced choroidal neovascularization in rats after retinal damage by sodium iodate injection［J］.Ophthalmic Res，2009，42(4):205-212.

［12］覃冬菊，唐羅生，劉湘平，等.激光誘導(dǎo)色素兔脈絡(luò)膜新生血管模型［J］.眼視光學(xué)雜志，2009，11(1):39-41.

［13］STAHL A，CONNOR K M，SAPIEHA P，et al.The mouse ret-ina as an angiogenesis model［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(6):2813-2826.

［14］KWAK N，OKAMOTO N，WOOD J M，et al.VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(10):3158-3164.

［15］ SAISHIN Y，SAISHIN Y，TAKAHASHI K，et al.VEGFTRAP(R1R2)suppresses choroidal neovascularization and VEGF-induced breakdown of the blood-retinal barrier［J］.J Cell Physiol，2003，195(2):241-248.

［16］NAKAI K，ROGERS M S，BABA T，et al.Genetic loci that control the size of laser-induced choroidal neovascularization［J］.FASEB J，2009，23(7):2235-2243.

［17］CRISWELL M H，CIULLA T A，HILL T E，et al.The squirrel monkey:characterization of a new-world primate model of experimental choroidal neovascularization and comparison with the macaque［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci 2004，45(2):625-634.

［18］WANG F，RENDAHL K G，MANNING W C，et al.AAV-medited expression of vascular endothelial growth factor induces choroidal neovascularization in rat［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(2):781-790.

［19］JULIEN S，KREPPEL F，BECK S，et al.A reproducible and quantifiable model of CNV induced by VEGF A165after subretinal adenoviral gene transfer in the rabbit［J］.Molecular Vision，2008，14:1358-1372.

［20］ZHONG X，HUANG H，SHEN J，et al.Vascular endothelial growth factor-B gene transfer exacerbates retinal and choroidal neovascularization and vasopermeability without promoting inflammation［J］.Molecular Vision，2001，17:492-507.

［21］QIU G，STEWART J M，SADDA S，et al.A new model of experimental subretinal neovascularization in the rabbit［J］.Experimental Eye Research，2006，83(1):141-152.

［22］TAMAI K，SPAIDE R F，ELLIS E A，et al.Lipid hydroperoxide stimulates subretinal choroidal neovascularization in the rabbit［J］.Experimental Eye Research，2002，74(2):301-308.

［23］FRAMME C，SACHS H G，KOBUCH K，et al.Clinical evaluation of experimentally induced choroidal neovascularizations in pigmented rabbits by subretinal injection of lipid hydroperoxide and consecutive preliminary photodynamic treatment with Tookad［J］.Ophthalmologica，2008，222(4):254-264.

［24］BABA T，BHUTTO I A，MERQES C，et al.A rat model for choroidal neovascularization using subretinal lipid hydroperoxide injection［J］.The American Journal of Pathology，2010，176(6):3058-3079.