陳猛，郝林，史振鐸，張輝，董洋，韓從輝

(1.東南大學醫(yī)學院，江蘇南京 210009;2.東南大學醫(yī)學院附屬徐州醫(yī)院泌尿外科，江蘇徐州 221009)

基因治療膀胱癌是現在的研究熱點，腺病毒是常用的載體之一。而超抗原靶向抗腫瘤模式為腫瘤治療提供了一個新的方向，并顯示出良好的應用前景。我們根據端粒酶高表達于人惡性腫瘤和缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在膀胱癌中表達上調的特點構建了攜帶超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxins A，SEA)基因的人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)/HIF雙調控溶瘤腺病毒PPE3-SEA。體外實驗證實，PPE3-SEA對人膀胱腫瘤EJ細胞具有殺傷作用［1］。然而免疫治療使得動物實驗無法使用裸鼠模型，因此hTERT啟動子和HIF啟動子能否在鼠腫瘤細胞中與相應的轉錄因子結合使SEA表達成為動物實驗的關鍵。Shieh等［2］實驗表明，在小鼠膀胱癌MBT-2中hTERT啟動子具有明顯活性并能使其下游的胞嘧啶脫氨酶基因表達。本實驗旨在觀察PPE3-SEA能否感染小鼠膀胱癌MB49并表達SEA基因。

1 材料和方法

1.1 材料

腺病毒PPE3-SEA由實驗組構建并保存，小鼠膀胱癌細胞MB49由天津泌尿外科研究所提供，RT-PCR試劑盒購自南京凱基公司，逆轉錄-聚合酶鏈反應引物合成于南京金斯瑞公司，SEA單克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 生物倒置顯微鏡下觀察細胞感染腺病毒后形態(tài)學變化

取對數生長期MB49細胞胰酶消化、離心，分別計數5×103接種到96孔板，待細胞貼壁后分別加入0、5、10、40 MOI腺病毒感染細胞，每組8個復孔。分別于12、24、48 h在OLYMPUS生物倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)并拍照。

1.3 RT-PCR檢測PPE3-SEA在MB49細胞內SEA的mRNA表達

根據GenBank已知的SEA基因序列用Primer 5軟件設計引物，上游引物:5'-TAGCGAGAAAAGCGAA-3'，下游引物:5'-ATCCAACTCCTGAACAG-3'。取對數生長期MB49細胞胰酶消化、離心，計數1×106個細胞加入10個培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后分別加入0、5、10、40 MOI腺病毒感染細胞，分別于 12、24、48 h 提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度后按試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。以GAPDH為內參照進行PCR擴增，循環(huán)參數為95℃預變性5 min;95℃變性40 s，52℃退火30 s，72℃延伸35 s，進行32個循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應結束后取反應液5μl進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR反應產物。

1.4 Western blot檢測SEA蛋白表達

取各組細胞于冷PBS洗滌后加入400μl冰預冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30 min，每隔5 min渦旋振蕩10 s，充分裂解后離心取上清分裝。Bradford法蛋白定量后用裂解緩沖液稀釋相同濃度，煮沸5 min后加樣電泳，濕電轉移，封閉;一抗1∶200稀釋，搖床搖蕩孵育;二抗1∶5 000稀釋，室溫下?lián)u蕩孵育2 h;加顯影液后曝光，顯影，洗像。

2 結 果

2.1 顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

未加腺病毒的細胞呈梭形;感染腺病毒的細胞呈圓形，細胞折光性增強，呈葡萄狀排列。病變細胞隨濃度的增加而增多，隨著感染時間延長，細胞折光性進一步增強，最終裂解(圖1)。

2.2 RT-PCR檢測mRNA表達

用SEA引物分別對陰性對照組48 h及實驗組各時段反轉錄產物進行PCR鑒定，結果顯示SEA在實驗組各時間段細胞中RNA水平成功表達，而陰性對照組未表達(圖2)。

2.3 Western blot檢測SEA蛋白表達

取陰性對照組48 h和實驗組各時段細胞進行免疫印跡分析，結果顯示:陰性對照組未檢測到SEA蛋白表達，而實驗組均檢測到SEA蛋白(圖3)。

3 討 論

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其臨床分期、病理學分級與多種基因表達相關［3-5］。目前治療膀胱癌的主要方法是以手術為主，術后輔以膀胱內灌注治療，但復發(fā)率高，治療效果遠不能讓人滿意。陳波等［6］回顧性分析經尿道膀胱腫瘤電切術加二次經尿道膀胱腫瘤電切術治療膀胱腫瘤，術后膀胱灌注吡柔比星，膀胱癌總復發(fā)率仍為18.37%，而開放行膀胱癌部分切除術組的總復發(fā)率高達33.5%。自Morales等［7］首先使用卡介苗(bacillus calmette-guerin，BCG)治療膀胱癌以來，膀胱癌的免疫治療得以迅速發(fā)展，但BCG膀胱灌注的并發(fā)癥(膀胱炎、血尿、發(fā)熱、肉芽腫、肺炎、膿毒癥、關節(jié)炎、關節(jié)痛、輸尿管梗阻和膀胱痙攣等)限制了其廣泛應用。在免疫治療過程中也可能會出現與免疫相關的疾病，因此膀胱癌的靶向免疫治療成為新的研究方向和熱點。hTERT啟動子被廣泛用于構建溶瘤腺病毒攜帶目的基因靶向治療腫瘤。在hTERT和mTERT啟動子的核心區(qū)有50%的相似性。Gu等［8］用 Ad/hTERT-LacZ感染小鼠纖維肉瘤細胞UV-2237m、Lewis肺癌細胞LLC、M109肺癌細胞、小鼠肺腺癌LM2細胞、小鼠成纖維細胞NIH3T3和正常鼠成纖維細胞NMFB檢測hTERT啟動子的活性，結果表明hTERT啟動子能有效地使用小鼠轉錄機，在小鼠腫瘤細胞中具有高活性而在正常細胞中相對靜止。我們實驗中發(fā)現PPE3-SEA腺病毒可以感染小鼠膀胱癌細胞MB49，最終導致細胞裂解并于感染腺病毒組均檢測到SEA的mRNA和蛋白的表達，再次證實hTERT啟動子和HIF啟動子能有效使用小鼠轉錄機。小鼠基因組測序計劃已完成，人類99%的基因存在于小鼠，基因組同源性高達78.5%，93%的區(qū)域基因排列順序與人類相同。龍躍生等［9］分析證明，人和小鼠SCN3A基因核心啟動子的同源性高達96.0%。以上研究結果為以啟動子作為靶向治療方法的實驗提供了新的參考方向和理論依據。

圖1 顯微鏡下不同濃度腺病毒感染腫瘤細胞后的各時段細胞形態(tài) ×200Fig 1 The cellular morphology of different time after infected by different concentration adenovirus under the microscope ×200

圖2 不同濃度腺病毒組各時段反轉錄產物鑒定Fig 2 The identification of reverse transcription's production

圖3 Western blot結果Fig 2 The results of Western blot

［1］胡建鵬，郝林，張培影，等.雙調控溶瘤腺病毒介導超抗原SEA基因靶向膀胱癌腫瘤表達［J］.中華實驗外科雜志，2010，27(8):1131-1133.

［2］SHIEH G S，SHIAU A L，YO Y T，et al.Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model［J］.Cancer Res，2006，66(20):9957-9966.

［3］楊立新，張海峰，白淑芬.P53、Ki-67基因表達與膀胱癌相關性的回顧性研究［J］.現代醫(yī)學，2010，38(1):32-35.

［4］應文群，李巧星.hTERT和survivin在膀胱癌移行細胞癌中的表達及意義［J］.腫瘤基礎與臨床，2006，19(1):19-20.

［5］何汀，陳明，章宜芬，等.Mel-18在人膀胱尿路上皮腫瘤組織中的表達及意義［J］.現代醫(yī)學，2010，38(3):212-216.

［6］陳波，賀厚光，韓從輝，等.二次經尿道膀胱腫瘤電切治療非浸潤性膀胱腫瘤［J］.東南大學學報:醫(yī)學版，2010，29(6):665-667.

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［9］龍躍生，趙綺華，曾濤，等.人及小鼠鈉通道SCN3A基因的啟動子及其上游調控區(qū)的分析［J］.生物化學與生物物理進展，2009，36(3):339-345.