陳圣林 ，王會(huì)娜 ，孫 穎 ，陳 顯 ，李建安

(1.中國(guó)林業(yè)產(chǎn)業(yè)聯(lián)合會(huì)，北京 100714；2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

三峽庫(kù)區(qū)14個(gè)李品種遺傳多樣性的ISSR分析

陳圣林1，王會(huì)娜2，孫 穎2，陳 顯2，李建安2

(1.中國(guó)林業(yè)產(chǎn)業(yè)聯(lián)合會(huì)，北京 100714；2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

以湖北省秭歸縣三峽庫(kù)區(qū)的14個(gè)李品種為研究材料，根據(jù)優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系，從24條引物中篩選出10條擴(kuò)增條帶特異性好、條帶數(shù)目適中、條帶清晰、重復(fù)性好的引物，總共擴(kuò)增出101條清晰可重復(fù)的DNA條帶，其中83條為多態(tài)性條帶，多態(tài)帶百分率為82.18%，每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶大小在300～3000 bp之間，數(shù)目在8～12條之間，平均為10.1條。應(yīng)用軟件POPGENE 1.31和NTSYS-pc對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，從而得出14個(gè)李品種的遺傳相似系數(shù)和遺傳遺傳距離，并繪制出品種相似性的UPGMA聚類(lèi)圖和主坐標(biāo)分析的二維、三維散點(diǎn)圖，結(jié)果表明:遺傳一致度的變化范圍在0.6022～0.8636之間，遺傳距離的變化范圍在0.146 7～0.507 2之間。根據(jù)品種相似性的聚類(lèi)圖和主坐標(biāo)分析圖，可將14個(gè)李品種分為3大類(lèi):美國(guó)布朗李系列品種、中國(guó)李系列品種以及介于兩者之間的雜合種，其中雜合種與中國(guó)李系列品種的遺傳相似性更高。

李；遺傳多樣性；遺傳距離；ISSR；PCR

李樹(shù)屬薔薇科Rosaceae李屬PrunusL植物，該屬大約有30余個(gè)種或變種[1]。李按其起源中心可分為3個(gè)系：①東亞系，主要有中國(guó)李、烏蘇里李、杏李等；②歐亞系，主要有歐洲李、櫻桃李、黑刺李、烏荊子李；③北美系，主要有美洲李、加拿大李、果醬李、天鵝李、狹葉李、亞心形李或太平洋李。李是我國(guó)栽培歷史悠久的果樹(shù)樹(shù)種。據(jù)考古學(xué)研究證明，遠(yuǎn)在5 000乃至6 000年前，我國(guó)的祖先己經(jīng)采食李的果實(shí)，用以充饑，有記載的栽培歷史在3500年以上[2]。到目前為止，我國(guó)李由8個(gè)種5個(gè)變種800余個(gè)品種及類(lèi)型，①中國(guó)李，其變種有毛梗李、柰李；②杏李；③烏蘇里李；④櫻桃李，其變種有紫葉李；⑤歐洲李；⑥美洲李；⑦黑刺李；⑧加拿大李[3]。

李樹(shù)樹(shù)種之間容易雜交培育出超過(guò)親本的雜交種，并容易培育出優(yōu)良無(wú)性系進(jìn)行無(wú)性繁殖，特別是從20世紀(jì)60年代開(kāi)始，我國(guó)引進(jìn)了很多國(guó)外李品種，在選出適宜的品種后，進(jìn)行種源和家系的篩選，然后選出優(yōu)良單株進(jìn)行無(wú)性繁殖，同時(shí)對(duì)不同種的優(yōu)良單株進(jìn)行雜交育種，選出超出親本的優(yōu)良雜交種進(jìn)行栽植推廣，造成我國(guó)現(xiàn)有李品種種源關(guān)系較為混亂，品種良莠不齊，不利于我國(guó)李產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因而，有必要對(duì)我國(guó)的李樹(shù)品種間進(jìn)行分子水平上的遺傳多樣性分析，為建立李樹(shù)種植資源庫(kù)打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

該實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自湖北省秭歸縣三峽庫(kù)區(qū)的14個(gè)李品種（見(jiàn)表1），于2009年10月采集各品種的新葉帶回實(shí)驗(yàn)室，并保存與-70 ℃冰箱中備用。

1.2 引物序列及合成

該研究所用的引物為參照有關(guān)文獻(xiàn)[4-7]，從哥倫比亞大學(xué)(UBC)設(shè)計(jì)的100條引物中篩選出24條引物序列，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 李樹(shù)基因組DNA的提取

該實(shí)驗(yàn)采用試劑盒法提取李樹(shù)葉片中的基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定OD260和OD280的值[8]，計(jì)算其濃度。

1.4 ISSR-PCR體系及引物的篩選

采用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系為:20 μL的反應(yīng)體系中，10×Buffer(Mg2+free)2.0 μL，1.5 U Tap DNA 聚合酶，0.5 μmol/L 的引物，0.2mmol/L的dNTPs，20 ng 模板DNA。最佳PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s；56℃退火1min；72℃延伸10 min；39個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，最后16 ℃保存10 min。

利用該體系，隨即篩選出3個(gè)種源在24條引物中篩選出適合14個(gè)李品種ISSR-PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性好的引物，然后再分別用不同的引物對(duì)14個(gè)李品種的基因組DNA進(jìn)行全面擴(kuò)增，每個(gè)引物重復(fù)3次，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 李樹(shù)基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

采用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取14個(gè)李品種的基因組DNA，通過(guò)純化后最終用TE緩沖液定容至100 μL，并用0.8瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，所提取的DNA條帶清晰，無(wú)明顯的拖帶現(xiàn)象，提取效果較好。通過(guò)核酸蛋白分析儀測(cè)定分析，所提取的基因組DNA的純度R(OD260/OD280)值在1.7～1.8之間，表明所提樣品中RNA與蛋白質(zhì)的含量較少，可以滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增的要求。

表1 李樹(shù)14個(gè)品種名稱(chēng)及樣品編號(hào)Table 1Number and name of 14 Prunus

圖1 李樹(shù)14個(gè)樣品的基因組DNA電泳圖像Fig.1Electrophoresis pattern of genomic DNA from 14 species of Prunus

2.2 李樹(shù)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用已經(jīng)優(yōu)化的李樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系，對(duì)24條引物進(jìn)行篩選，獲得10條適合14個(gè)李品種的ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的引物(見(jiàn)表2)，該10條引物的擴(kuò)增條帶特異、條帶數(shù)適中、清晰、可重復(fù)性好(見(jiàn)圖2)。

表2 李樹(shù)14個(gè)樣品的ISSR擴(kuò)增引物及獲得的條帶數(shù)Table 2Primers used for ISSR-PCR on 14 Prunus samples and band numbers of per primer

圖2 引物UBC 857對(duì)李樹(shù)14個(gè)樣品的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖像Fig.2PCR result of 14 Prunus samples by ISSR

10條引物對(duì)全部14個(gè)李品種擴(kuò)增，共擴(kuò)增出101條清晰且可重復(fù)的DNA條帶，其中有83條屬多態(tài)帶，每個(gè)引物所擴(kuò)增出來(lái)的DNA條帶數(shù)目不等，在8～13條之間，平均為10.1條，總多態(tài)百分率為82.18%，其中引物UBC866擴(kuò)增的多態(tài)帶百分率最高，為100%(見(jiàn)表2)。10條引物所擴(kuò)增的DNA片段的大小范圍在300～3000 bp，完全符合分子標(biāo)記對(duì)擴(kuò)增條帶的要求。

2.3 李樹(shù)的遺傳距離與遺傳一致度的分析

遺傳距離（genetic distance）和遺傳一致度（genetic identity）是用來(lái)衡量?jī)蓚€(gè)物種之間遺傳分化程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用Nei’s遺傳距離和遺傳一致度，并應(yīng)用POPGENE 1.31分析軟件對(duì)14個(gè)李品種進(jìn)行分析（見(jiàn)表3）。表2表明，14個(gè)李品種中，遺傳距離的變化范圍在0.146 7～0.507 2之間，遺傳一致度的變化范圍在0.6022～0.860 1之間。青皮麥李和紅皮麥李遺傳距離最小，為0.146 7，同時(shí)相應(yīng)的遺傳一致度最高，為0.8636；空心李和紅皮麥李具有最大的遺傳距離，為0.507 2，相應(yīng)的其遺傳一致度也最低，為0.6022。

2.4 李樹(shù)14個(gè)品種的親緣關(guān)系聚類(lèi)分析

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用NTSYS-pc軟件對(duì)14個(gè)李品種進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖3)[9]。圖3表明，14個(gè)李品種之間的親緣關(guān)系為:秭秋、秭露、秋露、梅李女皇之間的親緣關(guān)系較近，可聚為一組；變異株、黒霸、空心李、谷李、紫琥珀、早美麗、青皮麥李、大紅玫瑰、艷紅、紅皮麥李之間的親緣關(guān)系較近，聚為第二組。第二組中變異株和黒霸的親緣關(guān)系較近，空心李、谷李、早美麗、大紅玫瑰、艷紅之間的親緣關(guān)系較近，青皮麥李和紅皮麥李之間的親緣關(guān)系較近，紫琥珀與其他品種親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。11和14兩個(gè)品種間的遺傳相似性最近，既表明其親緣關(guān)系最近，與POPGENE 1.31軟件進(jìn)行分析是結(jié)果一致。

表3 李樹(shù)14個(gè)品種間的遺傳一致度(對(duì)角線上方)和遺傳距離(對(duì)角線下方)Table 3Nei’s original measures of genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)among 14 samples of Prunus

圖3 李樹(shù)14樣品相似性的UPGMA聚類(lèi)圖像Fig.3UPGMA dendrogram of genetic similarity among 14 samples of Prunus

2.5 李樹(shù)14個(gè)品種遺傳分化的主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析（Principal Coordinates Analysis）以品種間的相似性系數(shù)矩陣為基礎(chǔ)，建立新的坐標(biāo)系，不同品種在主坐標(biāo)圖中的位置能反映出它們之間的親緣關(guān)系。品種間位置越接近，表明它們的遺傳相似性越大，親緣關(guān)系越近，反之，則表明其遺傳差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)[9]。本實(shí)驗(yàn)在聚類(lèi)分析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用NTSYS-pc軟件對(duì)14個(gè)李品種進(jìn)行主坐標(biāo)分析，分別建立14個(gè)李品種的主坐標(biāo)二維散點(diǎn)圖（見(jiàn)圖4）和主坐標(biāo)三維散點(diǎn)圖（見(jiàn)圖5）。

圖4 李品種資源主坐標(biāo)分析二維散點(diǎn)圖像Fig.4 Two-dimensions scatter-graph of Prunus species by principal coordinate analysis

圖5 李品種資源主坐標(biāo)分析三維散點(diǎn)圖像Fig.5 Three-dimensions scatter-graph of Prunus species by principal coordinate analysis

從主坐標(biāo)二維散點(diǎn)圖和三維散點(diǎn)圖可以看出，秭秋、秭露、秋露、梅李女皇親緣關(guān)系較近，可聚為一類(lèi)；其它可聚為第二類(lèi)，其中青皮麥李和紅皮麥李親緣關(guān)系最近，與POPGENG軟件分析得出的遺傳距離與遺傳一致度關(guān)系基本一致。

3 結(jié)論與討論

采用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系，對(duì)李樹(shù)的14個(gè)品種進(jìn)行了擴(kuò)增，從24條引物中挑選出10條重復(fù)性好、條帶特異、多態(tài)性明顯且條帶清晰的引物。該10條引物對(duì)對(duì)14個(gè)品種分別擴(kuò)增出101條清晰可重復(fù)的DNA條帶，其中有83條屬于多態(tài)帶，平均每條引物為8.3條多態(tài)帶，各引物的多態(tài)百分率在63.6%～100%之間，平均為82.18%，其中擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度在300～3000 bp之間。通過(guò)POPGENE 1.31軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析得出，14個(gè)李品種的Nei’s遺傳距離的變化范圍在0.146 7～0.507 2之間，遺傳一致度的變化范圍在0.6022～0.860 1之間。

利用NTSYS-pc軟件對(duì)14個(gè)李品種進(jìn)行分析，得出14個(gè)品種的相似性UPGAM聚類(lèi)圖和主坐標(biāo)分析二維、三維散點(diǎn)圖，結(jié)果表明：14個(gè)品種中秭秋、秭露、秋露、梅李女皇4個(gè)李品種與其余10個(gè)李品種間遺傳分化較為明顯，遺傳多樣性較高，而該4個(gè)李品種間相似性較高，遺傳分化程度相對(duì)較小。該4個(gè)品種中秭秋、秭露、秋露是由布朗李系列品種中的佛萊索、秋姬、安哥諾引種馴化而來(lái)，而梅李女皇亦是由60年代由美國(guó)引進(jìn)的布朗李系列品種。紅皮麥李、青皮麥李、空心李、谷李、紅心李、密斯、黑霸、紫琥珀、早美麗、大紅玫瑰10個(gè)品種遺傳相似性較高，其中紅皮麥李、青皮麥李、空心李、谷李、紅心李為中國(guó)李品種，密斯李未中國(guó)李與櫻桃李的雜交種，紫琥珀、早美麗、大紅玫瑰為中國(guó)李與美國(guó)李的雜交種，其中雜交種的親緣關(guān)系與中國(guó)李更為接近，同時(shí)反映出李不同種源間具有較高的遺傳多樣性水平，這與其分布范圍廣泛有關(guān)。

ISSR分 子 標(biāo) 記 技 術(shù) 與ALFP、RLFE、RAPD、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)相比，具有可重復(fù)性高、多態(tài)性位點(diǎn)豐富、技術(shù)難度低、操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于品種間的遺傳多樣性分析、品種鑒定等分子研究方面的分子標(biāo)記技術(shù)，然而，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)也存在一些問(wèn)題，例如Tap酶濃度、Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度等條件對(duì)ISSR-PCR的影響較大，條件不適宜可能造成非特異性條帶較多、拖帶嚴(yán)重等現(xiàn)象[10-11]。同時(shí)部分條帶較弱，在進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)，這些弱帶是否被統(tǒng)計(jì)在內(nèi)，沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，主觀性較強(qiáng)，這就使遺傳多樣性分析、遺傳圖譜建立和品種鑒定等結(jié)果出現(xiàn)不穩(wěn)定性， 這些弱帶的原因可能是由于存在其他一些較亮的條帶，從而抑制了這些弱帶的擴(kuò)增或隨機(jī)引物在此結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合率較低等[12]。因此，針對(duì)這些問(wèn)題，我們還需要在以后的試驗(yàn)中繼續(xù)探討，以促進(jìn)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的成熟。

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ISSR analysis on genetic diversity of fourteen Prunus varieties in three gorges reservoir area

CHEN Sheng-lin1,WANG Hui-na2,SUN Ying2,CHEN Xian2,LIJian-an2
(1.Chinese Forestry Industry Association, Beijing 100714, China; 2.Central South University of Technology & Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

The 14Prunussamples from Zigui county, Hubei province, were used as the materials to analyze their genetic diversity.According to the improved ISSR-PCR reaction system and amplification condition, 10 primers were selected out from 24 random primers which can yield specific bands with moderate band numbers, clear background and well reproducibility. Total 101specific and reproducible DNA bands were obtained of which 83are polymorphic bands which polymorphism were 82.18%. Each primer can yield bands spanning 300～3000 bp and band number varies from 8 to 12(average 10.1). Biosofteares including POPGENE 1.31and NTSYS-pc were used to analyze the polymorphic bands obtained, and hence to yield the genetic similarity coeff i cient of the 14 samples and map the related graphics. The results show that the genetic identity varies between 0.6033～0.860 8, and the genetic distance varies between 0.146 7～0.507 2, and that the 14 samples ofPrunuscan be divided into three groups: the fi rst wasPrunus AmericanaMarsh,second wasPrunus salicina, the three was coeno-species. The higher genetic similarity was between coeno-species andPrunus salicina.

Prunus; genetic identity; genetic distance; ISSR; PCR

S794.4；S718.46

A

1673-923X(2012)09-0130-05

2012-08-15

林業(yè)公益行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201104052);國(guó)務(wù)院三峽辦移民科研項(xiàng)目(鄂移[2009]185)

陳圣林(1968-)，男，湖北天門(mén)人，工程師，博士，主要從事經(jīng)濟(jì)林栽培育種與產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)工作

[本文編校:吳 毅]