成骨細(xì)胞茜素紅染色方法改進(jìn)

摘要 目的：優(yōu)化茜素紅染色方法，應(yīng)用于干細(xì)胞成骨分化檢測。方法：干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化后，以70%乙醇進(jìn)行細(xì)胞固定，以pH值為8.3的PBS和Tris-HCl以及pH值為4.2的PBS和Tris-HCl配制茜素紅溶液，進(jìn)行成骨細(xì)胞染色。結(jié)果：不論是PBS還是Tris-HCl，pH值為8.3的較難染色，而pH值為4.2則可成功染色。結(jié)論：茜素紅溶液的pH值調(diào)整為4.2有利于成骨細(xì)胞染色。

關(guān)鍵詞 成骨細(xì)胞；固定液；茜素紅溶液；pH值

中圖分類號 R153 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1673-9671-（2012）122-0174-01

成骨分化是干細(xì)胞的一個重要特性。在特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用一段時間后，干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞，在細(xì)胞表面沉積鈣鹽，形成鈣結(jié)節(jié)。應(yīng)用茜素紅溶液對成骨細(xì)胞染色，茜素紅可與鈣離子螯合，產(chǎn)生紅色或紫紅色的復(fù)合物，可用于鑒定干細(xì)胞是否已成功向成骨細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

5～7月齡的新西蘭大白兔由蘇州大學(xué)南校區(qū)動物房獲得。

DMEM-LG培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、青-鏈霉素，購自Hyclone公司。

胰酶，購自Gibco公司。

成骨分化試劑，包括地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽，茜素紅，均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取

從5～7月齡的新西蘭大白兔中取出股骨和脛骨，放入含100 U/ml青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM-LG培養(yǎng)基中。在超凈臺中，將骨表面組織剃除干凈，以PBS沖洗。將骨骺最外端切開，以培養(yǎng)基將骨髓沖洗出來。骨髓液以1000 rpm離心，計數(shù)后以含10%胎牛血清和100 U/ml 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM-LG培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種在培養(yǎng)皿中，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。每2天換一次液。細(xì)胞在原代和傳代培養(yǎng)后貼壁生長。紅細(xì)胞和其他未貼壁的細(xì)胞則在換液時被移除2。

1.3 成骨誘導(dǎo)分化

將第2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以2×104 cells/cm2密度接種于24孔板內(nèi)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM-LG培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素、100 μg/mL鏈霉素）進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長至約80%時，以成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0.1 μM地塞米松、0.2 mM抗壞血酸磷酸鹽和10 mM β-甘油磷酸鈉）進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間為21天。

1.4 配制茜素紅染色液

分別以PBS或Tris-HCl配制0.1%茜素紅溶液，其pH值均調(diào)為8.3或4.2。

1.5 茜素紅染色

誘導(dǎo)結(jié)束后，以70%乙醇固定細(xì)胞1 h，以雙蒸水洗3次后，茜素紅溶液染色30 min。染色后以雙蒸水洗3遍后，置于顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 pH值為8.3的PBS溶液配制的茜素紅無法成功染色

將固定好的細(xì)胞以pH值為8.3的PBS溶液配制的茜素紅染色30 min后觀察，肉眼下看，細(xì)胞層幾乎無色。置于顯微鏡下觀察，細(xì)胞表面呈淡淡的粉色，并非明顯的紅色或紫紅色。將染色時間延長至1 h或染色過夜，結(jié)果仍然顯示未成功染色。

2.2 pH值為8.3的Tris-HCl溶液配制的茜素紅無法成功染色

操作同2.1。結(jié)果同樣顯示，不論染色時間多久，細(xì)胞仍然呈現(xiàn)較淺的顏色，未染色成功。

2.3 pH值為4.2的茜素紅溶液可成功染色

細(xì)胞固定后以pH值為4.2的茜素紅溶液染色，結(jié)果表明，不論是以PBS或Tris-HCl為溶劑，在30 min內(nèi)，茜素菜紅溶液可成功將誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞染色。細(xì)胞在肉眼觀察下即可發(fā)現(xiàn)呈明顯的紫紅色，在顯微鏡下可看見明顯的紫紅色鈣結(jié)節(jié)，細(xì)胞亦被染成紫紅色。

3 討論

以茜素紅溶液染色是鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的一個重要方法。間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化的過程中，在細(xì)胞表面沉積鈣鹽，形成鈣結(jié)節(jié)。茜素紅與鈣離子螯合可形成紫紅色或紅色復(fù)合物。而在正常培養(yǎng)條件下，鈣鹽作為難溶鹽，不以鈣離子存在。故在茜素紅溶液pH值為8.3的條件下，鈣結(jié)節(jié)無法被染色。而當(dāng)茜素紅溶液pH值被調(diào)節(jié)為4.2時，鈣鹽可解離出大量鈣離子，從而與茜素紅螯合形成復(fù)合物，可在顯微鏡下檢測出。因此，茜素紅溶液的pH值對于成骨細(xì)胞的成功染色至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhang J， Wang JH. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskelet Disord 2010；11：10.

[2]何志義，原麗英，陳晏，趙晶，鄒巧治，高卓，歐陽嶷.大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定的實驗研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，33（5）：395-396.

作者簡介

過倩萍（1985—），女，江西上饒人，碩士研究生，實驗技術(shù)員，蘇州大學(xué)骨科研究所，研究方向：干細(xì)胞與組織工程方向。