徐艷朋(綜述)，俞 松(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒矯形外科，貴州遵義 563099)

在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中，一些信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活起著重要的作用，目前發(fā)現(xiàn)Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路與人類絕大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，該通路中的任何組分發(fā)生突變都會(huì)影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化及凋亡，因此，對(duì)Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路的深入研究不僅對(duì)認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)防有重要意義，而且還可以通過干擾該通路的過度激活而達(dá)到在基因水平上治療腫瘤的目的。本文就Ras通路的激活以及與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 Ras信號(hào)通路的活化機(jī)制

1.1 Ras信號(hào)通路的概述 Ras信號(hào)通路也稱Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路或ERK信號(hào)通路，是由一個(gè)小GTP結(jié)合蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase MAPK)眾多通路中研究最多的一個(gè)，Ras信號(hào)通路主要由3種蛋白激酶構(gòu)成:①M(fèi)APKK激酶Raf，可磷酸化并激活下游的MEK;②絲裂原活化蛋白激酶的激酶(Mitogen－activated protein kinase kinase)MEK，能夠磷酸化并激活下游的ERK;③細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase)ERK，可磷酸化并激活多種下游底物。該通路是最重要的細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)通路之一，它不僅涉及細(xì)胞多種生理功能的調(diào)節(jié)，還在多種疾病的發(fā)病機(jī)制及病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，甚至在我們的行為反應(yīng)和認(rèn)知方面，如學(xué)習(xí)、記憶等過程中，都起著關(guān)鍵的作用［1］。

1.2 Ras信號(hào)通路中各組分的結(jié)構(gòu)與活化 Ras蛋白為只有一條多肽鏈的低分子質(zhì)量的三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)結(jié)合蛋白，包括兩種構(gòu)象:有活性的GTP結(jié)合構(gòu)象和無活性的GDP結(jié)合構(gòu)象，這兩種構(gòu)象在一定條件下可以互變，構(gòu)成Ras循環(huán)。外源性刺激如生長(zhǎng)因子(EGF、PDGF等)與胞膜上的受體結(jié)合，使受體上相應(yīng)的酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的酪氨酸殘基與Grb2(growth factor receptor－bound protein 2)的SH2區(qū)結(jié)合后，招募鳥苷酸交換因子SOS蛋白與Grb2的SH3區(qū)結(jié)合，使SOS蛋白定位于細(xì)胞膜上，形成復(fù)合物Grb2－SOS，Grb2－SOS與 Ras結(jié)合使 Ras－GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镽as－GTP，Ras被激活;激活后的Ras促使下游的Raf活化，Raf蛋白激酶是由Raf基因編碼的蛋白產(chǎn)物，是調(diào)控腫瘤血管生成的一個(gè)關(guān)鍵分子，在內(nèi)皮細(xì)胞生存和血管生成過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，共分為 A －Raf、B －Raf、Raf－1(或 C －Raf)三種亞類。與腫瘤細(xì)胞多種功能關(guān)系最為密切的是Raf－1，它的分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)保守區(qū)，其中第一個(gè)保守區(qū)CR1(61～194)是活化的Ras與Raf－1蛋白激酶結(jié)合的主要部位，激活后的Ras與其結(jié)合將使Raf－1固定于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，然后由其它非Ras依賴的信號(hào)分子激活;Raf－1活化后，它的C端催化區(qū)能與MEK1/2結(jié)合，并使其催化區(qū)第VIII亞區(qū)中的雙重磷酸化位點(diǎn)絲氨酸－xxx－絲/蘇氨酸(S－xxx－S/T)發(fā)生磷酸化，從而導(dǎo)致它的活化［2］?；罨腗EK再將細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)激活，ERK被快速地轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核去磷酸化和激活 AP － 1、ELK －1、SAP、c－Jun、c－Fos、c－Myc等涉及增殖反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄分子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及分化等多種生理過程，并在腫瘤惡變中起重要作用。

2 Ras信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖的作用

細(xì)胞的存活取決于增殖與凋亡的平衡，Ras信號(hào)通路參與了細(xì)胞的增殖與凋亡的過程，與細(xì)胞的存活密切相關(guān)，早期的研究認(rèn)為，Ras信號(hào)通路被激活后將促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，并抑制細(xì)胞的凋亡，即:細(xì)胞表面的受體活化后激活Ras通路，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)后活化ERK，活化的ERK可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)及細(xì)胞周期蛋白E(cyclinE)的表達(dá)，cyclinD1通過與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶－4(CDK4)結(jié)合，使細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期，cyclinE可以與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶－2(CDK2)結(jié)合，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞周期的進(jìn)行，促進(jìn)細(xì)胞的增殖等。但是現(xiàn)在越來越多的研究表明不同的外界刺激以及Ras信號(hào)通路激活的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間不同會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生不同的效應(yīng)，持續(xù)且強(qiáng)度適宜的激活對(duì)細(xì)胞增殖起到正性調(diào)控作用，過度激活能夠誘導(dǎo)一種細(xì)胞周期抑制蛋p21cip1的表達(dá)，p21cip1與CDK4結(jié)合使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，與CDK2結(jié)合則使細(xì)胞停滯在G1/S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖，此外過度激活的Ras信號(hào)通路使cyclinD1積聚，過度積聚的cyclinD1可與細(xì)胞周期抑制蛋白p21cip1結(jié)合，使 p21cip1免受降解，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入靜息狀態(tài)［3］。也能夠間接導(dǎo)致ROS的激活進(jìn)而參與細(xì)胞死亡效應(yīng)。

3 Ras信號(hào)通路在腫瘤發(fā)病中的作用

目前研究表明在許多惡性腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)Ras通路的異常激活，如:McCubrey等［4］在黑素瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌中等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Ras突變，Ras基因具有抑制腫瘤的功能［5］，它的單點(diǎn)突變足以引發(fā)惡性轉(zhuǎn)化［6］，另外突變的B－Raf蛋白第600位纈氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼釟埢?V600E)，導(dǎo)致下游MEK和ERK的異?；罨?，引起細(xì)胞增殖。其他的研究表明Raf－1、MEK、ERK在瘤體組織中的表達(dá)量高于正常組織，由此可見該信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。當(dāng)外界適當(dāng)?shù)拇碳ぜせ頡as信號(hào)通路后，Ras不僅可以募集Raf－1定位于細(xì)胞膜上，它和體內(nèi)鈣離子水平也能調(diào)節(jié)血管生成［7］。Raf－1被激活后可以繼續(xù)激活下游分子，同時(shí)Raf－1本身也有獨(dú)立于MEK、ERK的作用，其一，Raf－1與凋亡相關(guān)激酶作用而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡;其二，Raf－1還參與其他多種細(xì)胞生物學(xué)過程的信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控，是多種信號(hào)途徑的一個(gè)交聯(lián)點(diǎn)(如:Raf－1還參與G蛋白相關(guān)信號(hào)途徑)［8］，它的活化可以更廣泛的、多途徑的引起細(xì)胞增殖;其三，Raf－1可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)，刺激腫瘤血管的生成。Raf－1的這些作用均能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等。MEK不僅能夠激活ERK，并在生理?xiàng)l件下維持ERK的活化［9］，其本身也有促細(xì)胞增殖、分化及加速細(xì)胞周期進(jìn)展的作用。ERK被磷酸化，呈激活狀態(tài)(p－ERK)，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞遷移、粘附及向周圍間質(zhì)擴(kuò)展中發(fā)揮重要功能［10］。首先，p－ERK可以引起cyclinA和cyclinD1高表達(dá)，cyclinA激活Cdc2－cyclin進(jìn)而增加細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)cyclinD1促進(jìn)異源二聚體形成，導(dǎo)致Rb基因失活，上調(diào)cyclinE的表達(dá)，也可以使細(xì)胞的增殖能力增加，p－ERK本身在一定程度上影響著細(xì)胞G1期遺傳的不穩(wěn)定性，縮短細(xì)胞周期，最終引起腫瘤的發(fā)生。其次，p－ERK可以上調(diào)Mdm的表達(dá)，引起p53基因失活，使細(xì)胞無法修復(fù)DNA損傷，進(jìn)而引起了腫瘤的發(fā)生。再次，p－ERK使H3快速乙酰磷酸化，并激活c－jun、c－fos等，cjun、c－fos等異常表達(dá)又可以促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，同時(shí)增加AP－1的表達(dá)，引起腫瘤的發(fā)生。最后，活化的Erk1/2可以促進(jìn)Bcl－2的表達(dá)，抑制Cty c的釋放，維持線粒體的功能，抑制凋亡的發(fā)生［11－12］。此外，p－ERK 可以增加 NF －kB的表達(dá)及上調(diào)MMP，NF－kB促使Cox－2及PGE2的表達(dá)增加，發(fā)揮炎癥介質(zhì)的作用，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生［13］，另有研究表明ERK在MMP－9的基因表達(dá)中起作用［14］，MMP作為一類促血管生成因子，可以促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，引起腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。

4 Ras信號(hào)通路與腫瘤治療的現(xiàn)狀

大量的研究表明Ras信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)病中起著重要的作用，其治療腫瘤的手段也開始著重從直接或間接抑制Ras信號(hào)通路的作用方面入手，并在某些領(lǐng)域取得較大的進(jìn)展。

4.1 Ras基因靶點(diǎn)抑制劑 目前研究最多的是法尼基移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TIs)，主要包括 tipifarnib、lonafarnib和 BMS－214662。作用機(jī)制是通過抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶將法尼基結(jié)合到p21Ras羧基端的半胱氨酸(Cys)殘基，Cys殘基不能被羧甲基化，p21Ras就不能定位在細(xì)胞膜上，Ras不能被激活，從而抑制了Ras信號(hào)通路的傳導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生。tipifarnib是一種口服劑，臨床上大多與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，能產(chǎn)生協(xié)同作用，達(dá)到較好的治療效果。如:在過表達(dá)P－糖蛋白(permeability－glycoprotein，P－gp)的白血病細(xì)胞株CCRF－CEM和KG1a中，tipifarnib與柔紅霉素(daunorubicin，DNR)聯(lián)合，能抑制P－gp介導(dǎo)的蒽環(huán)類藥物流出效應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNR的敏感性［15］。tipifarnib還可以與其他藥物聯(lián)合，治療急慢性髓細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等。Lonafarnib為另外一種法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的口服劑，有研究證實(shí)在卵巢癌腫瘤移植模型中，lonafarnib與紫杉醇聯(lián)合使用和紫杉醇單藥相比，可導(dǎo)致腫瘤體積明顯消退(P ＜0.01)［16］。BMS －214662 是苯二氮卓類衍生的一類FTIs，當(dāng)與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可誘導(dǎo)增殖期和靜止期的腫瘤細(xì)胞凋亡［17］。FTS是人工合成的法尼基半胱氨酸類似物，不僅可以阻礙Ras蛋白錨定在細(xì)胞膜上，也可以解除這種錨定作用，同時(shí)將Ras蛋白懸停在細(xì)胞質(zhì)中，促使其加快降解進(jìn)而減少活化的Ras蛋白水平，最終降低癌癥的發(fā)生率［18］。此外還有抗p21Ras單克隆抗體，應(yīng)用抗p21Ras單克隆抗體Y13－259經(jīng)顯微注射入血清依賴性的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)能阻止血清誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)入S期，并且能使由活化的H－Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)［19］。

4.2 Raf激酶抑制劑的研究 通過抑制Raf激酶來達(dá)到治療腫瘤的目的:①Raf激酶抑制蛋白(RKIP)，它是一種在正常組織中也能夠表達(dá)的蛋白，并參與Raf轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，RKIP能與Raf－1結(jié)合，從而抑制Raf－1介導(dǎo)的MEK磷酸化和活化［20］，下調(diào)下游信號(hào)分子的表達(dá)，一些惡性腫瘤的發(fā)病正是由于RKIPmRNA及蛋白的表達(dá)水平下調(diào)而引起。RKIP還參與了蛋白激酶C(PKC)對(duì)Raf－1的活化作用，PKC可通過磷酸化RKIP(Ser－153)從而減弱 RKIP對(duì)Raf－1的抑制［21］。研究人員曾用RKIP基因轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)RKIP表達(dá)水平增高，Raf激酶活性下降，這給予我們啟示:或許將來能夠利用分子手段將RKIP基因直接轉(zhuǎn)染惡性腫瘤細(xì)胞來達(dá)到治療的目的。②苯并咪唑類化合物:Raf265［22］(Novartis)是一種口服的有效的Raf激酶小分子抑制劑，對(duì)三種 Raf亞型均可抑制，并抑制VEGFR－2激酶的活性來破壞腫瘤血管的生成。另外其他系列的苯并咪唑類化合物對(duì)Raf－1活性有較好的抑制性，甚至有些對(duì)其的抑制活性 IC50值達(dá)到了 0.14μmol/L［23］。目前這類藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并取得了較好的療效。③脲類Raf激酶抑制劑:Sorafenib是口服多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，該藥已應(yīng)用于臨床，主要治療腎細(xì)胞癌，并在臨床研究中證實(shí)對(duì)早期肝癌有較好的療效，并能夠延長(zhǎng)晚期肝癌患者的壽命，現(xiàn)已成為成人肝細(xì)胞癌的治療用藥［24］。④雙芳基咪唑類化合物:L－779450能阻斷細(xì)胞中血清依賴型MAPK的磷酸化［25］，實(shí)驗(yàn)研究表明 L－779450能抑制結(jié)腸癌、肺癌、惡性黑素瘤等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖。⑤其他:如噻吩并吡啶類化合物不僅對(duì)TNF－α、PDE4顯示出了較好的抑制活性，同樣也顯示出了 B － Raf抑制活性［26－27］。反義核苷酸ISIS5132［28］，它是一種含有20個(gè)堿基的反義寡核苷酸，通過RNA酶(RNaseH)可降解Raf－1mRNA，減少 Raf－1 蛋白的合成［29］，并在惡性腫瘤裸鼠移植模型中得到了證實(shí)。此外還有ZM －336372、噻唑類衍生物、SB－590885、PLX4032、吲哚酮類化合物 GW －5074、B－Raf激酶 ATP 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 CS292、CS240［30］等。

4.3 MEK激酶抑制劑的臨床研究及應(yīng)用 MEK抑制劑主要包括 U0126、PD98059、PD184352、PD032 5901、AZD6244等。U0126是一種高選擇性和高效的MEK阻滯劑，其最佳有效濃度30umol/L，通過直接抑制ERK1/2的上游激活物MEK的活性而阻滯ERK1/2的磷酸化，從而阻斷刺激信號(hào)向核內(nèi)傳遞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用MEK抑制劑U0126后，S期細(xì)胞比例和DNA合成顯著減少，體外集落形成大幅下調(diào)，裸鼠體內(nèi)移植瘤體積縮小。PD98059可以抑制MEK的磷酸化，阻斷其下游激酶ERKI/2的活化，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。PD184352是一種口服的高效MEK抑制劑，PD0325901與之為同源物，它們與雷帕霉素、紫杉醇等化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可增強(qiáng)藥物的療效，下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl－xl，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及癌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成等。AZD6244主要作用于MEK激活這個(gè)環(huán)節(jié)，使MEK雖能結(jié)合ATP和底物，但不能活化［29］，進(jìn)而MEK不能發(fā)揮作用，抑制了腫瘤的發(fā)展。此外，AZD6244與伊立替康或多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用與單藥相比都顯示了可增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)［31］，說明AZD6244還具有協(xié)同抗腫瘤作用。

4.4 ERK激酶抑制劑治療腫瘤的臨床研究ERK抑制劑apigenin能夠減弱5－HT通過Ras信號(hào)通路促進(jìn)腎系膜細(xì)胞內(nèi)TGF－β1mRNA的表達(dá)，來減輕腎小球硬化進(jìn)展［32］。治療宮頸癌運(yùn)用最廣泛的化療藥物順鉑的抗癌作用及耐藥又常常涉及ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活［33］。此外，從分子角度考慮，亦可人工合成一段肽，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ERK在MEK上的結(jié)合位點(diǎn)，抑制ERK的活性［34］，達(dá)到治療腫瘤的目的。

5 展望

經(jīng)過幾十年的研究，人們對(duì) Ras信號(hào)通路的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，不僅對(duì)該通路各個(gè)組分的結(jié)構(gòu)、功能和整個(gè)通路的活化機(jī)制有了透徹的了解，更對(duì)其與腫瘤發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系有了深入的研究，在一些惡性腫瘤中，如肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、鼻咽癌、膽管癌、急慢性髓細(xì)胞性白血病等，均發(fā)現(xiàn)了Ras信號(hào)通路的異常激活，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出了通過干預(yù)Ras通路而達(dá)到治療腫瘤的藥物，部分已應(yīng)用于臨床。但是腫瘤的發(fā)生并不是簡(jiǎn)單的一個(gè)通路的激活引起的，并且Ras通路也與其他通路及因子之間有著密不可分的聯(lián)系，只有將這些引起腫瘤發(fā)病的因素作為一個(gè)整體來分析，才能更好解決腫瘤的治療問題，甚至更好預(yù)防腫瘤的發(fā)生，防患于未然。

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