梁廣勝，殷明，劉玉亮，何丁文

椎間盤是脊柱椎體間的主要連接組織，極富有彈性，可以均衡椎體間相互作用的生物力和緩沖外界壓力，對(duì)人體的運(yùn)動(dòng)、穩(wěn)定、平衡等有著重要的生物學(xué)意義。

目前，椎間盤退行性病變的患病率明顯增加，且呈年輕化趨勢。椎間盤退變是一種與年齡相關(guān)的疾病，引起退變的因素眾多，其共同特點(diǎn)是髓核細(xì)胞(NPC)數(shù)量減少和功能減退、細(xì)胞外基質(zhì)含量明顯下降且比例失調(diào)。這些都是椎間盤細(xì)胞衰老或凋亡的表現(xiàn)。椎間盤細(xì)胞的衰老和凋亡是其組織退變過程中一個(gè)非常關(guān)鍵的因素[1]。對(duì)椎間盤退變的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退行性病變是從纖維環(huán)中央的髓核細(xì)胞衰老開始，并進(jìn)行程序性退變的過程[2]。

成年人的髓核細(xì)胞壽命很短，自我更新能力有限。伴隨著髓核細(xì)胞分裂次數(shù)增加，端粒長度不斷減少；當(dāng)端?？s短到一定的程度，即所謂末端限制片段(TRF)的長度為5～7 kb時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入危機(jī)期M1(crisis M1)，從而觸發(fā)某種信號(hào)，使其在細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)(check point)處受阻，致使髓核細(xì)胞退出細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞衰老。

研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶(telomerase)對(duì)椎間盤細(xì)胞的生命周期和活性具有調(diào)節(jié)作用[3]。因此從端粒酶調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞的角度研究和探討其對(duì)延緩椎間盤退變的機(jī)理，對(duì)重建結(jié)構(gòu)、恢復(fù)功能具有十分重要的意義。

1 端粒酶結(jié)構(gòu)和功能

端粒酶是一個(gè)具有逆轉(zhuǎn)錄酶功能的核糖核蛋白(ribosenuclearprotein,RNP)復(fù)合酶，包含端粒酶RNA(the telomerase RNA,TR)、端粒酶催化蛋白亞基(catalytic protein subunit or telomerase reverse transcriptase,TERT)和相關(guān)性輔助蛋白(telomerase accessory protein)[4]。TR核酸序列的數(shù)量、排列順序和方式與物種相關(guān)。人類TR(hTR)成分于1995年首次克隆成功，并證實(shí)hTR有451個(gè)核苷酸組成。TR序列和長度都有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)和相對(duì)穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。Cohen等用色譜法測定人端粒酶復(fù)合物的分子質(zhì)量是650 kDa～670 kDa，并測定其為TERT(127 kDa)、TR(153 kDa)和 dyskerin(57 kDa)組成的二聚體[5]。

TR是端粒酶結(jié)構(gòu)的催化核心不可或缺的部分之一，并提供端粒延長所需的重復(fù)序列的模板，這個(gè)非編碼RNA包含的基元與端粒酶活性重組有著密切聯(lián)系。

端粒酶輔助蛋白成分大約分為端粒酶RNP相關(guān)蛋白、TERT相關(guān)蛋白及TR相關(guān)蛋白。這些蛋白對(duì)端粒酶的組裝、定位、激活和核糖核苷酸生物合成以及維持端粒酶的穩(wěn)定性，都起著重要的作用。

TERT又稱端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，起源于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，并在其他輔助酶作用下發(fā)揮作用——利用RNA合成DNA。HTERT是人類端粒酶催化活性組件的核心成分，是端粒酶發(fā)揮生物學(xué)作用的功能中心，也是端粒酶激活的限速酶。hTERT在眾多水平上發(fā)揮作用，包括基因的表達(dá)、剪切，蛋白質(zhì)的折疊、翻譯后修飾，嚴(yán)格控制和管理端粒酶的活性等。HTERT與端粒DNA特異性識(shí)別并結(jié)合，通過合成重復(fù)序列(5'-GGT TAG-3')并連接到端粒的末端來維持染色體在復(fù)制過程中動(dòng)態(tài)平衡、穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長，進(jìn)而參與人體細(xì)胞的衰老和凋亡的調(diào)節(jié)[6]。

椎間盤細(xì)胞的增殖和生長也受到端粒酶活性調(diào)節(jié)。研究顯示，在退變的椎間盤細(xì)胞內(nèi)，端粒酶的活性受到抑制或破壞，不能有效維持染色體平衡，導(dǎo)致端粒在復(fù)制過程中持續(xù)性縮短，促進(jìn)細(xì)胞的老化和加快椎間盤退變的進(jìn)程[7-8]。Kim等對(duì)椎間盤細(xì)胞衰老的機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性和端粒的長度隨椎間盤退變的程度加重而降低或縮短，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)端粒酶活性降低能促進(jìn)椎間盤組織內(nèi)的衰老細(xì)胞的積累[9]。以上研究表明，端粒酶的生物學(xué)功能與椎間盤發(fā)生退行性病變有著十分密切的關(guān)系。

Geserick等發(fā)現(xiàn)，缺乏端粒酶的小鼠會(huì)提前衰老，并且器官和組織(包括椎間盤)的功能明顯降低；當(dāng)小鼠重新重新獲得具有活性的端粒酶后，其組織重新修復(fù)，功能恢復(fù)到實(shí)驗(yàn)前的水平，細(xì)胞老化也發(fā)生逆轉(zhuǎn)[10]。Jaskelioff等研究也證實(shí)了端粒酶可以逆轉(zhuǎn)端粒酶缺失導(dǎo)致的組織變性，治療與年齡相關(guān)的疾病如椎間盤退變[11]。這些為端粒酶治療椎間盤退變提供了一定的理論基礎(chǔ)和前提。

2 端粒酶延緩椎間盤退變的細(xì)胞機(jī)制

端粒酶負(fù)責(zé)維持端粒動(dòng)態(tài)平衡。端粒酶介導(dǎo)的TTAGGG重復(fù)序列合成可以彌補(bǔ)染色體在復(fù)制過程中的丟失和損壞，以維持端粒長度的平衡、維持基因完整性和染色體穩(wěn)定性，進(jìn)而影響細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化、自我更新和增殖，對(duì)延長細(xì)胞壽命具有重要意義，甚至可能誘導(dǎo)細(xì)胞逃脫程序性死亡，獲得無極限的增殖能力，即永生化。

端粒酶能從細(xì)胞維護(hù)和保養(yǎng)方面延緩椎間盤退行性病變。Liang等用端粒酶基因轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，產(chǎn)生一個(gè)永久性的椎間盤細(xì)胞系：被轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞后代生長速度明顯增快；將這種細(xì)胞和正常的髓核細(xì)胞放在一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)正常髓核細(xì)胞的壽命也明顯延長[12]。Chung等用非病毒脂質(zhì)體介導(dǎo)端粒酶基因轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，端粒酶能增強(qiáng)髓核細(xì)胞的分裂能力，延長髓核細(xì)胞壽命至496 d，髓核細(xì)胞基質(zhì)在282 d內(nèi)持續(xù)表達(dá)，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的合成量大約是對(duì)照組的46倍和32倍，直至細(xì)胞衰老[13]。實(shí)驗(yàn)表明端粒酶除了能延長細(xì)胞壽命外，還能促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的合成與分泌。Wu等通過端粒酶基因轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，髓核細(xì)胞中衰老細(xì)胞的百分比為30%～3%(端粒酶基因轉(zhuǎn)染后)和64%～4%(對(duì)照組)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)物，如膠原蛋白在120 d內(nèi)明顯增加，第21天最明顯，產(chǎn)量是對(duì)照組的7.2倍[14]。Niu等通過端粒酶活性很高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和正常的髓核細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞合成的細(xì)胞外基質(zhì)，如蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白含量明顯增多，髓核細(xì)胞生長速率加快[15]。hTERT基因轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞相比正常髓核細(xì)胞，壽命明顯延長，增殖速度加快[12]。

端粒酶除了能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分泌和延長壽命以外，還有其他的生物作用。Ruan等通過用端粒酶陽性的Wharton's jelly cells(WJCs)定向培養(yǎng)和誘導(dǎo)髓核細(xì)胞分化，成功地發(fā)現(xiàn)有新的髓核細(xì)胞生成[16]，表明端粒酶對(duì)髓核細(xì)胞的分化起著重要的作用。Sharma等發(fā)現(xiàn)，端粒酶具有增加染色體組型的穩(wěn)定性和增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)的能力[17]。端粒酶還具有抗轉(zhuǎn)化生長因子β的表達(dá)、促進(jìn)生長因子的合成、抑制金屬蛋白細(xì)胞酶、抑制細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路、誘導(dǎo)過氧化氫介導(dǎo)的損傷等多種生物學(xué)功能。這些功能對(duì)椎間盤組織修復(fù)和延緩?fù)诵行圆∽冇兄匾饬x。

Bodnar等將TERT基因轉(zhuǎn)染到端粒酶陰性的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)端粒酶可以延長細(xì)胞的壽命，維持細(xì)胞的正常核型和細(xì)胞表型的年輕態(tài)，不會(huì)發(fā)生細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[18]。被轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞后代表現(xiàn)出生長速度快，并成功傳代20代以上；轉(zhuǎn)染后髓核細(xì)胞無惡變，而是保持典型的原代細(xì)胞形態(tài)特征和染色體穩(wěn)定的表征[12]。在正常的干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和新生組織內(nèi)，端粒酶活性很高。這提示端粒酶不具有致癌性。

3 端粒酶延緩椎間盤退變的信號(hào)通路

從細(xì)胞學(xué)角度分析，椎間盤退行性病變是由于椎間盤細(xì)胞發(fā)生了衰老或凋亡，具有活性的細(xì)胞數(shù)目減少。細(xì)胞的老化是在應(yīng)對(duì)外界各種生物力的條件下，程序性地發(fā)生細(xì)胞的生理功能下降和紊亂。目前椎間盤發(fā)生退行性病變的具體機(jī)制還不清楚。而了解并控制椎間盤細(xì)胞生長和分化的信號(hào)通路有助于椎間盤潛在的治療。

Tabach等通過研究椎間盤細(xì)胞功能和端粒酶以及p53活性誘導(dǎo)其下游的168個(gè)基因表達(dá)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞G1/S期，hTERT的表達(dá)比較密集，能上調(diào)p53基因的活性，原癌基因誘導(dǎo)的衰老(oncogene-induced senescence,OIS)明顯受到抑制；在衰老的椎間盤組織中，細(xì)胞hTERT活性降低，未能抑制p53基因的活性，導(dǎo)致p53大量表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在p16基因沉默狀態(tài)下，細(xì)胞周期明顯縮短，OIS被激活，細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)處于相當(dāng)高的水平；將抑制p53和p16的抑制物導(dǎo)入椎間盤組織中，喪失自我更新能力的細(xì)胞功能又得到恢復(fù)[19]。推測端粒酶延緩椎間盤退變的機(jī)制與其調(diào)節(jié)p53-p21-pRb途徑和p16-pRb途徑有緊密聯(lián)系。最近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制還與Wnt/β-catenin途徑有關(guān)。

3.1 p53-p21-pRb通路

伴隨椎間盤細(xì)胞的分裂和增殖，其細(xì)胞DNA末端的端粒發(fā)生進(jìn)行性縮短。當(dāng)椎間盤細(xì)胞端粒長度到達(dá)某一臨界值(Hayflick limit)時(shí)，DNA發(fā)生損傷反應(yīng)，端粒的功能也發(fā)生明顯障礙，從而觸發(fā)DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)(DNA damage response，DDR)，這與磷酸化形式的H2AX組蛋白變體(G-H2AX)和DDR蛋白53BP1、NBS1、MDC1有關(guān)，同時(shí)DDR相關(guān)激酶ATM和ATR也被激活，進(jìn)而引起細(xì)胞的衰老和凋亡[20]。而端粒酶通過修復(fù)端粒長度和上調(diào)抑癌基因p53的轉(zhuǎn)錄活性，以及降低依賴p53的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，繼而通過p53-p21-pRb通路提高椎間盤細(xì)胞對(duì)p53導(dǎo)致衰老的抵抗力。

p53基因是一種腫瘤抑制蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，通過細(xì)胞周期蛋白(cyclins)－細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶(CDKs)－細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(CKIs)的網(wǎng)絡(luò)來完成對(duì)細(xì)胞周期G1/S期和G2/M期的調(diào)控。p53能通過調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和序列特異性DNA結(jié)合區(qū)誘導(dǎo)其下游眾多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而p53在端粒酶活性較高水平的情況下，表達(dá)水平會(huì)明顯降低，導(dǎo)致被p53轉(zhuǎn)錄激活的p21WAF1/cip1(CDK激活酶的抑制因子)也明顯減少，導(dǎo)致其與cyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合的能力下降，上調(diào)它們的激酶活性，促其磷酸化pRb。Rb蛋白在磷酸化狀態(tài)下，與轉(zhuǎn)錄因子E2Fs結(jié)合明顯下調(diào)，使其釋放具有轉(zhuǎn)錄因子活性的E2Fs。從而使E2F與其靶基因結(jié)合增強(qiáng)，靶基因表達(dá)增強(qiáng)后，椎間盤細(xì)胞進(jìn)入S期，最終導(dǎo)致處于G1/S期的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。

G1/S期是細(xì)胞周期中的3個(gè)關(guān)卡(check point)，即G1/S期、G2/M期以及紡錘體裝配關(guān)卡中最重要的一個(gè)關(guān)卡。它也是細(xì)胞周期中的一個(gè)限速步驟[21]。Kim等通過對(duì)人類椎間盤退變的機(jī)制研究證實(shí)，在所有衰老髓核細(xì)胞中，端粒酶的活性明顯受到抑制或破壞，其調(diào)節(jié)的p53、p21和pRb表達(dá)同時(shí)呈強(qiáng)陽性[9]。Liang等進(jìn)一步證實(shí)，將端粒酶基因轉(zhuǎn)入的髓核細(xì)胞內(nèi)，端粒酶的活性明顯增強(qiáng)，其調(diào)節(jié)的p53表達(dá)水平降低，p53-p21-pRb通路受到抑制，能延緩髓核細(xì)胞的衰老過程和椎間盤退行性病變進(jìn)程[12]。

3.2 p16Ink41-pRb通路

p16基因又叫多腫瘤抑制(multiple tumor suppressor,MTS)基因，是迄今為止得到公認(rèn)的抑癌基因，也是一種直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的基因。它能負(fù)向調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞自我更新能力。Beach等證明，P16蛋白是CDK4和CDK6抑制因子的關(guān)鍵酶之一，P16通過取代細(xì)胞周期蛋白cyclinD與CDK4和CDK6結(jié)合，使細(xì)胞周期中cyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2蛋白復(fù)合物的活性受到降低或抑制，使pRb處于去磷酸化或低磷酸化狀態(tài)而減少轉(zhuǎn)錄因子E2Fs釋放，從而阻止DNA的生物合成，促使細(xì)胞停滯在G1/S期，進(jìn)一步阻礙細(xì)胞的有絲分裂。這就是經(jīng)典的p16Ink41-pRb通路。研究發(fā)現(xiàn)，在端粒酶活性處于高水平時(shí)，椎間盤組織內(nèi)的細(xì)胞p16Ink41-pRb途徑的表達(dá)明顯受到抑制[22]。Park等證實(shí)，老化的髓核細(xì)胞中，端粒酶的活性受到抑制或破壞，而這些衰老細(xì)胞的p16Ink41表達(dá)均呈免疫強(qiáng)陽性；通過誘導(dǎo)p16Ink41-pRb通路的激活，能加速髓核細(xì)胞的衰老和凋亡，進(jìn)而能推動(dòng)椎間盤發(fā)生退行性病變的進(jìn)程[23]。表明端粒酶調(diào)節(jié)p16Ink41-pRb通路與延緩椎間盤退變的過程也有著密切聯(lián)系。但是兩者之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

3.3 Wnt/β-catenin通路

端粒酶是Wnt/β-catenin通路的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的輔助因子，與BRG1(一個(gè)SWI/SNF相關(guān)的染色質(zhì)重塑蛋白)相互作用，激活TOP-FLASH受體來驅(qū)動(dòng)其他β-catenin的靶基因，包括cyclinD1、c-myc和siamois來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，并通過抑制Wnt/β-catenin的信號(hào)進(jìn)而調(diào)節(jié)WNT蛋白以及相關(guān)保護(hù)性蛋白的合成和分泌來維護(hù)椎間盤細(xì)胞的活性[24-25]。TERT可以通過Wnt/βcatenin通路調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞內(nèi)的代謝因子以及分解因子的合成和分泌，并使其處于動(dòng)態(tài)平衡中，也能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來增強(qiáng)細(xì)胞的自我更新能力[26]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與椎間盤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及細(xì)胞的老化有著密切的聯(lián)系。Yuasa等發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在椎間盤退變發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用[27]。Hiyama等發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在維持椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定中起著重要的作用[28]。激活椎間盤細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，細(xì)胞增殖率明顯降低，細(xì)胞周期停滯在G2/M期，從而加速椎間盤退行性病變的進(jìn)程。

Wnt/β-catenin信號(hào)分子的受體是卷曲蛋白(Frizzled)，而其輔助受體是低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(RP5/6)。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的下游樞紐信號(hào)因子。當(dāng)胞外存在Wnt信號(hào)通路特異性抑制物端粒酶時(shí)，WNT蛋白與其受體的結(jié)合受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)下游蛋白質(zhì)降解復(fù)合物合成，包括結(jié)腸腺瘤樣息肉(APC)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、軸蛋白(axin)和酪蛋白激酶1(casein kinase 1,CK1)。細(xì)胞質(zhì)中的axin/GSK-3/APC/CK1復(fù)合體與β-catenin結(jié)合后，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子β-catenin的降解。與此同時(shí)，該降解物上的GSK-3β能將磷酸基團(tuán)加到β-catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上使βcatenin發(fā)生磷酸化；磷酸化后的β-catenin通過泛素化途徑被蛋白酶體降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的β-catenin總體水平明顯降低。而β-catenin能進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞因子(TCF/LEF)、DNA結(jié)合形成三元復(fù)合物，改變DNA的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄活化因子P300/CBP家族、myc基因家族以及cyclinD1、c-myc與siamois等，啟動(dòng)靶基因的表達(dá)，使細(xì)胞無法進(jìn)入M期，而停滯于G2/M期。TERT下調(diào)β-catenin表達(dá)水平，使其進(jìn)入細(xì)胞核的數(shù)量減少，降低β-catenin對(duì)椎間盤細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)節(jié)。TERT還能調(diào)節(jié)WNT3A配體，有效誘導(dǎo)axin2的合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的G1/S期，并且在一定條件下可以促進(jìn)Wnt通路的自我更新、增殖或生存[25]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一種在進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路，參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等廣泛的生物學(xué)過程。這些功能對(duì)減緩椎間盤退變有生物學(xué)意義。

4 討論及展望

通過探討端粒酶對(duì)椎間盤細(xì)胞生物學(xué)功能以及相關(guān)信號(hào)通路的影響，我們發(fā)現(xiàn)，端粒酶對(duì)椎間盤細(xì)胞調(diào)控是一個(gè)多因子參與、多水平調(diào)節(jié)的過程，涉及到細(xì)胞整體功能水平、基因水平、信號(hào)通路的分子水平等。端粒酶不僅能通過p53-p21-pRb通路、p16Ink41-pRb通路和Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞的自我更新，還能促進(jìn)椎間盤細(xì)胞延長壽命、增殖、分泌和維持基因遺傳穩(wěn)定性、DNA修復(fù)等眾多功能。目前，端粒酶延緩椎間盤退變的研究主要集中在如何減緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤組織退變以及具體的機(jī)制方面，實(shí)驗(yàn)研究顯示端粒酶能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原等細(xì)胞基質(zhì)，恢復(fù)退變的人髓核細(xì)胞的活性，刺激相關(guān)基因的表達(dá)，并對(duì)退變?cè)缙诘淖甸g盤尤其是髓核組織具有修復(fù)功能，是轉(zhuǎn)基因療法治療椎間盤疾病比較理想的目的基因。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性TERT基因可有效誘導(dǎo)端粒酶的合成和調(diào)節(jié)端粒酶的活性，有助于椎間盤細(xì)胞在有絲分裂過程中維持端粒長度的動(dòng)態(tài)平衡，保持染色體的穩(wěn)定性和完整性，從而延緩椎間盤組織的退變。

雖然在體外實(shí)驗(yàn)中，端粒酶基因治療椎間盤退變的研究得到良好的效果，但在臨床中仍然存在著許多需要解決的問題：①目的基因的表達(dá)時(shí)間短，在臨床中應(yīng)用有一定的局限；②椎間盤病變的相關(guān)基因仍不明確，外源性基因轉(zhuǎn)入、表達(dá)的有效性及其調(diào)控機(jī)制仍不完善；③多數(shù)椎間盤退行性病變動(dòng)物模型是通過人為因素如物理或化學(xué)損傷實(shí)現(xiàn)，這與自然發(fā)生的人椎間盤退行性變的生物學(xué)改變有一定區(qū)別。

迄今為止，人類已經(jīng)成功利用端粒酶基因治療與年齡相關(guān)性的疾病，如心血管疾病和白血病。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各項(xiàng)試驗(yàn)研究的開展、深入、完善，端粒酶用于臨床預(yù)防和治療椎間盤突變必將有廣闊前景。

[1]Le Maitre CL,Freemont AJ,Hoyland JA.Accelerated cellular senescence in degenerate intervertebral discs:a possible role in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration[J].Arthritis Res Ther,2007,9(3):R45.

[2]Freemont AJ,Watkins A,Le Maitre C,et al.Current understanding of cellular and molecular events in intervertebral disc degeneration:implications for therapy[J].J Pathol,2002,196(4):374-379.

[3]Podlevsky JD,Chen JJ.It all comes together at the ends:Telomerase structure,function,and biogenesis[J].Mutat Res,2012,730(1-2):3-11.

[4]Mason M,Schuller A,Skordalakes E.Telomerase structure function[J].Curr Opin Struct Biol,2011,21(1):92-100.

[5]Cohen SB,Graham ME,Lovrecz GO,et al.Protein composition of catalytically active human telomerase from immortal cells[J].Science,2007,315(5820):1850-1853.

[6]Tsang AR,Wyatt HD,Ting NS,et al.hTERT mutations associated with idiopathic pulmonary fibrosis affect telomerase activity,telomere length,and cell growth by distinct mechanisms[J].Aging Cell,2012,11(3):482-490.

[7]Zhao CQ,Wang LM,Jiang LS,et al.The cell biology of intervertebral disc aging and degeneration[J].Ageing Res Rev,2007,6(3):247-261.

[8]Choudhary B,Karande AA,Raghavan SC.Telomere and telomerase in stem cells:relevance in ageing and disease[J].Front Biosci(Schol Ed),2012,4:16-30.

[9]Kim KW,Chung HN,Ha KY,et al.Senescence mechanisms of nucleus pulposus chondrocytes in human intervertebral discs[J].Spine J,2009,9(8):658-666.

[10]Geserick C,Tejera A,Gonzalez-Suarez E,et al.Expression of mTert in primary murine cells links the growth-promoting effects of telomerase to transforming growth factor-beta signaling[J].Oncogene,2006,25(31):4310-4319.

[11]Jaskelioff M,Muller FL,Paik JH,et al.Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice[J].Nature,2011,469(7328):102-106.

[12]Liang W,Ye D,Dai L,et al.Over expression of hTERT extends replicative capacity of human nucleus pulposus cells,and protects against serum starvation-induced apoptosis and cell cycle arrest[J].J Cell Biochem,2012,113:2112-2121.

[13]Chung SA,Wei AQ,Connor DE,et al.Nucleus pulposus cellular longevity by telomerase gene therapy[J].Spine(Phila Pa 1976),2007,32(11):1188-1196.

[14]Wu J,Wang D,Zhang C,et al.Extending the activities of human nucleus pulposus cells with recombinant adeno-associated virus vectormediated human telomerase reverse transcriptase gene transfer[J].Tissue Eng Part A,2011,17(19-20):2407-2415.

[15]Niu CC,Yuan LJ,Lin SS,et al.Mesenchymal stem cell and nucleus pulposus cell coculture modulates cell profile[J].Clin Orthop Relat Res,2009,467(12):3263-3272.

[16]Ruan D,Zhang Y,Wang D,et al.Differentiation of human Wharton's jelly cells toward nucleus pulposus-like cells after coculture with nucleus pulposus cells in vitro[J].Tissue Eng Part A,2012,18(1-2):167-175.

[17]Sharma GG,Gupta A,Wang H,et al.hTERT associates with human telomeres and enhances genomic stability and DNA repair[J].Oncogene,2003,22(1):131-146.

[18]Bodnar AG,Ouellette M,Frolkis M,et al.Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells[J].Science,1998,279(5349):349-352.

[19]Tabach Y,Milyavsky M,Shats I,et al.The promoters of human cell cycle genes integrate signals from two tumor suppressive pathways during cellular transformation[J].Mol Syst Biol,2005,1:2005 0022

[20]Kuilman T,Michaloglou C,Mooi WJ,et al.The essence of senescence[J].Genes Dev,2010,24(22):2463-2479.

[21]Deckbar D,Jeggo PA,Lobrich M.Understanding the limitations of radiation-induced cell cycle checkpoints[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2011,46(4):271-283.

[22]Egbuniwe O,Idowu BD,Funes JM,et al.P16/p53 expression and telomerase activity in immortalized human dental pulp cells[J].Cell Cycle,2011,10(22):3912-3919.

[23]Park JB,Lee JK,Park SJ,et al.Mitochondrial involvement in fas-mediated apoptosis of human lumbar disc cells[J].J Bone Joint Surg Am,2005,87(6):1338-1342.

[24]Choi J,Southworth LK,Sarin KY,et al.TERT promotes epithelial proliferation through transcriptional control of a Myc-and Wnt-related developmental program[J].PLoS Genet,2008,4(1):e10.

[25]Park JI,Venteicher AS,Hong JY,et al.Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin[J].Nature,2009,460(7251):66-72.

[26]Friedman KL.Telomerase reverse transcriptase and Wnt signaling[J].Mol Cell Biol,2011,31(12):2366-2368.

[27]Yuasa T,Otani T,Koike T,et al.Wnt/beta-catenin signaling stimulates matrix catabolic genes and activity in articular chondrocytes:its possible role in joint degeneration[J].Lab Invest,2008,88(3):264-274.

[28]Hiyama A,Sakai D,Risbud MV,et al.Enhancement of intervertebral disc cell senescence by WNT/beta-catenin signaling-induced matrix metalloproteinase expression[J].Arthritis Rheum,2010,62(10):3036-3047.