喬 燕，劉學(xué)波*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

活性氧(ROS)是需氧有機(jī)體細(xì)胞正常代謝所伴隨的副產(chǎn)物，正常生物體具有維持活性氧平衡生理濃度的功能，但當(dāng)機(jī)體內(nèi)過多的ROS與抗氧化物質(zhì)不足同時(shí)存在時(shí)，機(jī)體將處于一種不平衡代謝狀態(tài)，造成機(jī)體氧化應(yīng)激而損傷生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂類等，引起其結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致機(jī)體生理和病理的改變[1]。蛋白質(zhì)占細(xì)胞和組織干質(zhì)量的68%，是生物功能的主要體現(xiàn)者，因此成為ROS在生物體內(nèi)的主要攻擊標(biāo)靶[2]。從生化機(jī)制方面來看，ROS可以通過直接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈氧化，也可通過脂質(zhì)過氧化和糖基化等過程間接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，而蛋白質(zhì)羰基化則是蛋白質(zhì)直接和間接氧化的結(jié)果之一，是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個(gè)重要標(biāo)記[3]。研究表明，蛋白質(zhì)的氧化損傷可造成許多重大疾病，如帕金森(PD)、阿爾茨海默(AD)和肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)等衰老相關(guān)疾病[4]，腫瘤[5]及其他疾病[6]。因此抗氧化劑的開發(fā)以及對機(jī)體生物大分子的保護(hù)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。近年，大量研究已證實(shí)，黃酮類物質(zhì)，如黃芩黃素、黃芩苷、槲皮素、假荊芥屬苷等[7-11]，具有較強(qiáng)清除自由基的能力及抗衰老、抗癌、消炎、抑制糖尿病并發(fā)癥等功能。

草質(zhì)素(herbacetin)是3,4’,5,7,8-五羥基取代的黃酮類物質(zhì)(圖1)，主要存在于筆筒草、紅景天、棉花等植物中[12-13]。目前，國內(nèi)外鮮有對草質(zhì)素生物活性及藥理活性的研究報(bào)道，而研究表明，酚羥基官能團(tuán)的位置及個(gè)數(shù)對抗氧化性起重要的作用[14-15]，鑒于草質(zhì)素的結(jié)構(gòu)中含有5個(gè)酚羥基，推測其可能具有較強(qiáng)的體外抗氧化性[16]。因此本實(shí)驗(yàn)擬初步探討草質(zhì)素清除自由基及預(yù)防蛋白氧化、減少蛋白羰基化，以期為草質(zhì)素在天然抗氧化劑和功能性食品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

圖1 草質(zhì)素結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of herbacetin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草質(zhì)素(純度＞98%) 上海永恒生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)美國Sigma公司；Anti-DNP、Anti-Rabbit 美國Santa Cruz公司；噻唑蘭(MTT)、2,4-二硝基苯肼(DNPH) 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

680酶標(biāo)儀、165-8001垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；QYC110臺式恒溫振蕩器 上海?，敼?；AUY220萬分之一天平 日本島津公司；微量移液槍德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

草質(zhì)素溶液(50mmol/L)：稱取草質(zhì)素粉末0.00302g，溶于200μL甲醇(純度95.5%)中，－20℃避光保存，用甲醇稀釋成不同濃度的草質(zhì)素工作液。

DDPH溶液(1mmol/L)：稱取0.00786g DPPH溶于20mL 甲醇(純度95.5%)，避光保存。

DNPH溶液(20mmol/L)：0.39628g DNPH溶于100mL 0.2mol/L HCl中，避光保存。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定

參考Mishra等[17]的方法略有改動。向離心管中加入49μL甲醇及1μL不同濃度的草質(zhì)素溶液，再分別加入50μL DPPH溶液，混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30min，點(diǎn)樣于96孔板，517nm波長處測定吸光度，記為Ai；同時(shí)以99μL的甲醇與1μL草質(zhì)素溶液混合后的吸光度記為Aj；以50μL的DPPH溶液與50μL的甲醇混合后的吸光度記為A；以100μL甲醇的吸光度記為A0。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(1)。

1.3.3 羥自由基(·OH)清除能力測定

參照陳金娥等[18]的方法略有改動。向離心管中加入96μL超純水、4μL不同濃度草質(zhì)素溶液以及100μL 6mmol/L FeSO4、100μL 2.4mmol/L H2O2溶液，混合均勻，在室溫下靜置10min，再加入100μL水楊酸，37℃水浴反應(yīng)30min，點(diǎn)樣于96孔板，510nm波長處測定吸光度，記為Ai；同時(shí)以296μL超純水與4μL甲醇、100μL 6mmol/L水楊酸混合后的吸光度記為A。羥自由基清除率計(jì)算如公式(2)。

1.3.4 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷

向離心管中加入97μL BSA蛋白溶液(本反應(yīng)體系BSA蛋白溶液質(zhì)量濃度均為0.6mg/mL)和1μL草質(zhì)素溶液，混合均勻，室溫孵育30min，再分別加入1μL 100 mol/L Cu2+和2.5mmol/L H2O2，37℃水浴90min；同時(shí)以97μL BSA蛋白溶液與1μL甲醇、2μL 10mmol/L PB緩沖液(pH 6.0)混合液作為陽性對照；以97μL BSA蛋白溶液、1μL甲醇、1μL Cu2+和1μL H2O2(Cu2+和H2O2的濃度同上)的混合液作為陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后，加入25μL SDS，95℃水浴5min，使蛋白充分變性。同體積的蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳后，0.15%的考馬斯亮藍(lán)R-250染色30min，脫色過夜，蛋白含量由Quantity One 4.6.2軟件分析。草質(zhì)素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷的保護(hù)率計(jì)算如公式(3)。

式中：ρ表示Cu2+/H2O2單獨(dú)處理后，剩余BSA蛋白密度；ρi表示不同濃度草質(zhì)素預(yù)處理，再經(jīng)Cu2+/H2O2處理后，剩余BSA蛋白密度。

1.3.5 Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白羰基化

將1.3.4節(jié)中制備好的蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳后，10V 25min轉(zhuǎn)印，使凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜再與DNPH溶液衍生30min，2mol/L HCl洗滌3次，每次5min，甲醇洗滌5次，每次5min。5%脫脂乳室溫封閉2h，TBST洗滌。用抗DNP抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌，Anti-Rabbit抗體室溫孵育2h，TBST洗滌，化學(xué)成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)羰基化的產(chǎn)生。草質(zhì)素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA蛋白羰基化的抑制率計(jì)算如公式(4)。

式中：ρ表示Cu2+/H2O2單獨(dú)處理后，剩余BSA蛋白密度；ρi表示不同濃度草質(zhì)素預(yù)處理，再經(jīng)Cu2+/H2O2處理后，剩余BSA蛋白密度。

1.3.6 AAPH誘導(dǎo)BSA蛋白氧化損傷

向離心管中加入50μL BSA蛋白溶液(本反應(yīng)體系中BSA蛋白溶液質(zhì)量濃度均為1.2mg/mL，PB濃度同上)，1μL草質(zhì)素溶液和29μL PB溶液，混合均勻，室溫孵育30min，再分別加入20μL 500mmol/L AAPH溶液，37℃反應(yīng)6h；同時(shí)以50μL BSA蛋白溶液、1μL甲醇及49μL PB混合液作為陽性對照組；以50μL BSA蛋白溶液、1μL甲醇、29μL PB和20μL 500mmol/L AAPH的混合液作為陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后，加入25μL SDS，95℃反應(yīng)5min，使蛋白充分變性。同體積的蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳后，0.15%的考馬斯亮藍(lán)R-250染色30min，脫色過夜，蛋白含量由Quantity One 4.6.2 軟件分析。

1.3.7 AAPH誘導(dǎo)BSA蛋白羰基化

將1.3.5節(jié)中制備好的蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳后，10V 25min轉(zhuǎn)印，使凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜再與DNPH衍生30min，2mol/L HCl洗滌3次，每次5min，甲醇洗滌5次，每次5min。5%脫脂乳室溫封閉2h，TBST洗滌。用抗DNP抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌，Anti-Rabbit抗體室溫孵育2h，TBST洗滌，化學(xué)成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)羰基化的產(chǎn)生。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007處理，DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 草質(zhì)素對DPPH自由基清除能力

圖2 草質(zhì)素對DPPH自由基清除的作用Fig.2 Scavenging effect of herbacetin on DPPH radical

由圖2可知，不同濃度草質(zhì)素對DPPH自由基均有顯著的清除作用。在濃度10～100μmol/L的范圍內(nèi)，草質(zhì)素對DPPH自由基的清除率隨著其濃度增大而增大，依次為19.14%、32.00%、56.98%、83.22%，其IC50值為49.28μmol/L，即14.88μg/mL。與江巖等[19]測定的VC清除DPPH自由能力相比(IC50=4.09μg/mL)，草質(zhì)素清除DPPH自由基能力略弱于VC。

2.2 草質(zhì)素對·OH清除能力

由圖3可知，草質(zhì)素能夠顯著地清除·OH，在10～50μmol/L濃度范圍內(nèi)，其清除能力沒有明顯變化。濃度為100、250、500μmol/L時(shí)，清除率分別達(dá)到35.97%、52.66%、62.61%，其清除·OH的IC50值為219.20μmol/L，即66.20μg/mL，參照郭松年[20]的研究可知，草質(zhì)素清除·OH的能力略高于VC(IC50=89μg/mL)。由清除DPPH自由基和·OH的IC50值可知，草質(zhì)素清除DPPH自由基的能力明顯強(qiáng)于·OH，而VC清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于草質(zhì)素，清除·OH的能力略低于草質(zhì)素。

圖3 草質(zhì)素對羥自由基清除的作用Fig.3 Scavenging effect of herbacetin on hydroxyl radical

2.3 草質(zhì)素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷的保護(hù)作用

圖4 草質(zhì)素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of herbacetin against oxidative damage of BSA induced by Cu2+/H2O2

由圖4可知，不同濃度草質(zhì)素均可顯著保護(hù)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷。Cu2+催化H2O2產(chǎn)生的·OH可顯著的誘導(dǎo)BSA蛋白損傷，經(jīng)過不同濃度的草質(zhì)素處理后，可保護(hù)蛋白免受·OH的氧化，其保護(hù)率分別為55.00%、112.00%、139.00%和252.00%。

2.4 草質(zhì)素對AAPH誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷的保護(hù)作用

由圖5可知，濃度在10～100μmol/L范圍內(nèi)，草質(zhì)素均可顯著保護(hù)AAPH誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷。AAPH經(jīng)熱分解產(chǎn)生以碳為中心的自由基，在氧氣的參與下，進(jìn)一步生成·OOH而導(dǎo)致BSA蛋白發(fā)生氧化損傷[21]，而草質(zhì)素可防止蛋白損傷。當(dāng)濃度達(dá)到100μmol/L時(shí)，其對AAPH誘導(dǎo)的BSA蛋白損傷的保護(hù)作用已接近未經(jīng)AAPH處理組。

圖5 草質(zhì)素對AAPH誘導(dǎo)的BSA蛋白氧化損傷的保護(hù)作用Fig.5 Protective effect of herbacetin against oxidative damage of BSA induced by AAPH

2.5 草質(zhì)素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白羰基化的抑制作用

圖6 草質(zhì)素對Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的蛋白羰基化的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of herbacetin on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation

由圖6可知，草質(zhì)素可抑制Cu2+/H2O2誘導(dǎo)的BSA蛋白羰基化，50、100μmol/L草質(zhì)素能顯著抑制蛋白質(zhì)羰基化的發(fā)生，抑制率分別為21%、50%。但10、25μmol/L組的抑制作用不明顯，原因可能是低濃度草質(zhì)素清除羥自由基的能力較弱，還不能防止羥自由基對蛋白側(cè)鏈氨基酸的攻擊。

2.6 草質(zhì)素對AAPH誘導(dǎo)的BSA蛋白羰基化的抑制作用

由圖7可知，經(jīng)AAPH處理后，也可顯著地誘導(dǎo)BSA發(fā)生羰基化，不同濃度的草質(zhì)素前處理，均可抑制羰基化的發(fā)生，且隨著草質(zhì)素濃度的增加，羰基化的程度逐漸減弱。濃度為25、50、100μmol/L時(shí)，羰基化程度與AAPH組相比分別降低了1.2、2.1倍和2.9倍。

圖7 草質(zhì)素對AAPH誘導(dǎo)的蛋白羰基化的抑制作用Fig.7 Inhibition effect of herbacetin on AAPH -induced protein carbonylation

3 結(jié) 論

蛋白質(zhì)是生物體的重要組成成分，在生命活動中擔(dān)負(fù)著重要功能。其側(cè)鏈的賴氨酸、精氨酸、脯氨酸和蘇氨酸等殘基易受自由基攻擊而發(fā)生蛋白氧化損傷，蛋白質(zhì)羰基化則是蛋白質(zhì)的氨基酸殘基受到攻擊而生成的NH3和相應(yīng)羰基衍生物，其含量的多少間接反應(yīng)了蛋白質(zhì)的氧化損傷程度[22-25]。本研究通過對DPPH自由基和·OH清除能力的測定，表明草質(zhì)素能顯著清除這兩種自由基，但清除DPPH自由基的能力要強(qiáng)于·OH。當(dāng)BSA蛋白用Cu2+/H2O2或AAPH處理后，可顯著的誘導(dǎo)BSA蛋白氧化及羰基化，原因在于Cu2+催化H2O2產(chǎn)生的·OH和AAPH產(chǎn)生的·OOH自由基攻擊蛋白質(zhì)，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸殘基被修飾，分子構(gòu)象的改變[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，草質(zhì)素可使蛋白氧化及羰基化的程度降低，原因可能是草質(zhì)素能清除自由基，阻止了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)導(dǎo)致的對蛋白質(zhì)的氧化攻擊。

綜上所述，草質(zhì)素可顯著清除自由基及防止蛋白發(fā)生氧化。該研究為草質(zhì)素預(yù)防某些與蛋白氧化損傷有關(guān)的疾病及功能性食品的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。然而，有關(guān)草質(zhì)素藥理及病理活性尚不清楚，還需進(jìn)一步深入。

[1]許曼音, 陸廣華, 陳名道.糖尿病學(xué)[M].上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2010: 124-125.

[2]WRIGHT A, BUBB W A, HAWKINS C L, et al.Singlet oxygenmeidated protein oxidation: evidence for the formation of reactive side chain peroxides on tyrosine residues[J].Photochemistry and Photobiology, 2002, 76(1): 35-46.

[3]李國林, 印大中.ROS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化的生化機(jī)制[J].生命的化學(xué), 2007, 27(6): 516-520.

[4]SAYRE L M, SMITH M A, PERRY G.Chemistry and biochemistryof oxidative stress in neurodegenerative disease[J].Current Medicinal Chemistry, 2001, 8(7): 721-738.

[5]ISHII T, YASUDA K, AKATSUKA A, et al.A mutation in the SDHC gene of complex increases oxidative stress resulting in apoptosis and tumorigenesis[J].Cancer Research, 2005, 65(1): 203-209.

[6]FENKCI V, FENKCI S, YILMAZER M, et al.Decreased total antioxidant status and increased oxidative stress in women with polycystic ovary syndrome may contribute to risk of cardiovascular disease[J].Fertil Steril, 2003, 80(1): 123-127.

[7]GAO Zhonghong, HUANG Kaixun, LIANG Xianliang, et al.Free radical scavenging and antioxidant activities of flavonoids extracted from the radix ofScutellaria baicalensisGeorgi[J].Biochimica et Biophysica acta-General Subjects, 1999, 1472(3): 643-650.

[8]COSKUN O, KANTER M, KORKMAZ A, et al.Quercetin, a flavonoid antioxidant, prewents and protects streptozotocin-induced oxidative stress and β-cell damage in rat pancreas[J].Pharmacological Research, 2005, 51(2): 117-123.

[9]TERAO J.Dietary flavonoids as antioxidants[J].Forum Nutrition,2009, 61: 87-94.

[10]LOPEZ-LAZARO M.Flavonoids as anticancer agents: structureactivity relationship study[J].Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents, 2002, 2(6): 691-714.

[11]AGARWAL O P.The anti-inflammatory action of nepitrin, a flavonoid[J].Inflammation Research, 1982, 12(3): 298-302.

[12]PANGAROVA T T, ZAPESOCHNAYA G G, NUKHIMOVSKII E L.Flavonoids ofRhodiola algida[J].Chemistry of Natural Compound,1974, 10(5): 685-686.

[13]NEELAKANTAM K, SESHADRI T R.Pigments of cotton flowers.Part IV.Constitution of herbacitrin and herbacetin-new glucoside and aglucone (flavonol)[J].Proceedings Mathematical Sciences, 1937,5(4): 357-364.

[14]FENG Jianying, LIU Zaixun.Phenolic and enolic hydroxyl groups in curcumin: which plays the major role in scavenging radicals[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2009, 57(22): 11041-11046.

[15]CHEN Z Y, CHAN P T, HO K Y, et al.Antioxidant activity of natural flavonoids is governed by number and location of their aromatic hydroxyl groups[J].Chemistry and Physics of Lipids, 1996, 79(2): 157-163.

[16]LEE D H, SZCZEPANSKI M, LEE Y J.Role of Bax in quercetininduced apoptosis in human prostate cancer cells[J].Biochemical Pharmacology, 2008, 75(12): 2345-2355.

[17]MISHRA K, OJHA H, CHAUDHURY N K.Estimation of antiradical properties of antioxidants using DPPH· assay: a critical review and results[J].Food Chemistry, 2012, 130: 1036-1043.

[18]陳金娥, 豐慧君, 張海容.紅茶、綠茶、烏龍茶活性成分抗氧化性研究[J].食品科學(xué), 2009, 30(3): 62-66.

[19]江巖, 鄭力, 克熱木江·吐爾遜江.藥桑甚花青素的體外抗氧化作用[J].食品科學(xué), 2011, 32(13): 45-48.

[20]郭松年.石榴汁花色苷穩(wěn)定性、抗氧化性及其組分鑒定[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2008.

[21]MURAOKA S, MIURA T.Protection by estrogens of biological damage by 2, 2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride[J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 82: 343-348.

[22]LEVINE R L, GARLAND D, OLIVER C N, et al.Determination of carbonyl contents in oxidatively modified proteins[J].Methods in Enzymology, 1990, 186: 464-478.

[23]文鏡, 張春華, 董雨, 等.蛋白質(zhì)羰基含量與蛋白質(zhì)氧化損傷[J].食品科學(xué), 2003, 24(10): 153-157.

[24]DALLE-DONNE I.Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress[J].Clinica Chimica Acta, 2003, 329: 23-38.

[25]張文玲, 魏麗勤, 王林嵩, 等.活性氧對生物大分子的氧化性損傷[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 28(4): 69-71.

[26]BRAUGHLER J M, DUNCAN L A, CHASE R L.The involvement of iron in lipid peroxidation[J].Journal of Biological Chemistry, 1986,261: 10282-10289.

[27]KANG K A, CHAE S, KOH Y S, KIM J S, et al.Protective effect of puerariae radix on oxidative stress induced by hydrogen peroxide and streptozotocin[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28:1154-1160.

[28]ZHAO Yuling, LI Hailing, GAO Zhonghong, et al.Effects of flavonoids extracted fromScutellaria baicalensisGeorgi on hemin-nitrite-H2O2induced liver injury[J].European Journal of Pharmacology, 2006, 536: 192-199.