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      江蘇草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑的抗藥性

      2013-02-23 04:57:34潘以樓朱桂梅
      江蘇農(nóng)業(yè)學報 2013年2期
      關(guān)鍵詞:抗藥性灰霉病多菌靈

      潘以樓, 朱桂梅, 郭 建

      (江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所,江蘇 句容212400)

      灰霉病是由葡萄孢屬真菌引起的一種世界性的重要病害[1-2]。草莓灰霉病是草莓上為害最普遍、最嚴重的病害之一,一般減產(chǎn)10.0% ~30.0%,重者達50%以上[3]。迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)對草莓灰霉病具有抗性的品種[4]。目前生產(chǎn)上主要應(yīng)用多菌靈、腐霉利、乙霉威、異菌脲、嘧霉胺等殺菌劑控制草莓灰霉?。?-6]?;颐共【蚓哂屑闹鞣秶鷱V、繁殖快和遺傳變異頻繁等特點,使其極易對殺菌劑產(chǎn)生抗性[4]。據(jù)報道,草莓灰霉病菌對多菌靈[7]、腐霉利[8]、異菌脲[9]、乙霉威[10]均已產(chǎn)生抗藥性,其中對多菌靈抗藥性較強。嘧霉胺在蔬菜上應(yīng)用的時間不長,但番茄等茄科蔬菜灰霉病菌對其也產(chǎn)生了抗藥性[11-12];本世紀初,嘧霉胺開始在江蘇草莓種植區(qū)使用,2007 年浙江省2 個地區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性為24%[13],到目前為止江蘇地區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性發(fā)生狀況還未見報道。

      雖然已有研究報道草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、菌核凈、乙霉威存在抗藥性[7-9],其中對多菌靈抗性菌株的分布有比較詳細的研究[7],而對腐霉利、異菌脲、菌核凈、乙霉威抗性菌株的分布還未見詳細報道。

      為了明確江蘇草莓灰霉病菌對殺菌劑抗藥性的現(xiàn)狀,筆者在2011 ~2012 年在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū)采集、分離草莓灰霉病菌菌株,在室內(nèi)測定這些菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威的敏感性,為草莓灰霉病的防治提供技術(shù)支撐。

      1 材料與方法

      1.1 供試菌株

      2011 年和2012 年5 月,在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū)句容市天王鎮(zhèn)、句容市白兔鎮(zhèn)、宜興市宜城鎮(zhèn)、盱眙縣三河鎮(zhèn)和東海縣黃川鎮(zhèn)采集草莓灰霉病病果,用滅菌的木質(zhì)牙簽輕觸病果上灰霉病菌霉層,迅速放入馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)斜面上帶回實驗室。一個病果作為一個菌株,用PSA 培養(yǎng)基進行單孢純化后轉(zhuǎn)至PSA 斜面上,保存于4 ℃冰箱中供試。

      1.2 培養(yǎng)基

      PSA 培養(yǎng)基[14]用于草莓灰霉病菌分離、菌株保存及草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的敏感性測定。

      Chapeland 培養(yǎng)基[11,15]用于草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性測定。

      1.3 供試藥劑

      95.0 %嘧霉胺(Pyrimethanil)原藥,由江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn);96.0%多菌靈(Carbendazim)原藥,由上海升聯(lián)化工有限公司生產(chǎn);98.0%腐霉利(Procymidone)原藥,由江西禾益化工有限公司生產(chǎn);96.2%異菌脲(Iprodione)原藥,由江蘇快達農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn);95.0%乙霉威(Diethofencarb)原藥,由江蘇蘇化集團新沂農(nóng)化有限公司生產(chǎn)。

      多菌靈原藥用0.1 mol/L HCl 溶液溶解成1 000 μg/ml母液。其他原藥均用少量丙酮溶解原藥配制成1 000 μg/ml 的母液,并在母液中加入2.0%Tween-80 作為乳化劑。

      1.4 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性測定

      采用菌絲生長速率法測定草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性[16]。用滅菌蒸餾水稀釋嘧霉胺母液制成系列濃度的藥液,并加入45 ℃Chapeland 培養(yǎng)基中制成最終含藥量為0 μg/ml、0.003 2 μg/ml、0.016 0 μg/ml、0.080 0 μg/ml、0.400 0 μg/ml、2.000 0 μg/ml、10.000 0 μg/ml的含藥平皿。從PSA 平板上培養(yǎng)3 d 的草莓灰霉病菌菌落邊緣,取直徑為5 mm的菌碟,并把其菌絲面向下接種于含藥平板上,每皿1 個菌碟,每處理3 次重復。于25 ℃培養(yǎng)4 d 后,用十字交叉法量取菌落直徑(mm),取平均值后再減去原菌碟直徑(5 mm)后,計算抑制率,抑制率=[(未加藥處理的菌落直徑-加藥處理的菌落直徑)/未加藥處理的菌落直徑]×100%。

      采用幾率值法,通過濃度對數(shù)值(x)和抑制率機率值(Y)之間的線性回歸關(guān)系,計算嘧霉胺對草莓灰霉病菌各菌株的抑制中濃度(EC50)。

      1.5 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗性檢測

      采用最低抑制濃度法(MIC)檢測草霉灰霉病菌對各藥劑的抗藥性[7]。多菌靈的鑒別濃度設(shè)置為5.000 0 μg/ml[7],異菌脲的鑒別濃度設(shè)置為5.000 0 μg/ml[9],乙 霉 威 的 鑒 別 濃 度 設(shè) 置 為0.500 0 μg/ml[10],腐 霉 利 的 鑒 別 濃 度 設(shè) 置 為10.000 0 μg/ml[10]。PSA 培養(yǎng)基在55 ℃時加入各藥劑,分別制成含多菌靈5.000 0 μg/ml、異菌脲5.000 0 μg/ml、乙霉威0.500 0 μg/ml、腐霉利10.000 0 μg/ml的含藥平皿。將待檢測的灰霉病菌各菌株在PSA 平皿上培養(yǎng)3 d 后取直徑為5 mm 的菌片移至各含藥平皿上,在25 ℃下培養(yǎng)3 d,不能或幾乎不能在該鑒別濃度上正常生長的為敏感菌株,能正常生長的為抗性菌株。

      1.6 數(shù)據(jù)分析

      所有計算均用DPS 軟件進行,并用Excel 進行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析和制圖。

      2 結(jié)果

      2.1 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性分布

      2011 年采集的草莓灰霉病菌133 個菌株對嘧霉胺的敏感性差異較大,嘧霉胺抑制灰霉病菌菌絲生 長 的EC50值 最 低 為0.015 9 μg/ml,最 高 為14.134 9 μg/ml。嘧霉胺對2012 年采集的草莓灰霉病菌206 個菌株抑制菌絲生長的EC50值為0.012 5 ~20.195 5μg/ml。2011 和2012 年采集的草莓灰霉病菌菌株對嘧霉胺的敏感性(EC50值)分布表現(xiàn)為敏感菌株比例和高抗菌株比例較高,而中間的低抗菌株較少。

      2.2 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

      2011 年和2012 年在江蘇5 個草莓產(chǎn)區(qū)分別采集133 個菌株和206 個菌株,檢測這些菌株對嘧霉胺的敏感性,按照嘧霉胺抑制菌絲生長的抑制中濃度(EC50值)大小區(qū)分菌株對嘧霉胺的抗性程度。菌株對嘧霉胺抗性程度依據(jù)紀明山等[17]所報道的灰霉病菌對嘧霉胺的敏感基線值(0.0911 0 μg/ml)進行判別,當菌株EC50值小于敏感基線值5 倍,即EC50值小于0.455 5 μg/ml 為敏感菌株;當菌株的EC50值處于敏感基線值5 ~10 倍,即EC50值在0.455 5 ~0.911 0 μg/ml 為 低 抗 菌 株;當 菌 株 的EC50值 處 于 敏 感 基 線 值10 ~40 倍,即EC50在0.911 0 ~3.644 0 μg/ml為中抗菌株;當某菌株的EC50值大于敏感基線值40 倍,即EC50高于3.644 0 μg/ml為高抗菌株[18]。結(jié)果(表1)顯示,2011 年133 個菌株中,對嘧霉胺敏感菌株占22.6%,對嘧霉胺低抗菌株、中抗菌株和高抗菌株分別占15.8%、39.1%和23.3%;2012 年206 個菌株中,對嘧霉胺敏感菌株占34.0%,對嘧霉胺低抗菌株、中抗菌株和高抗菌株分別占1.0%、5.8%和59.2%。檢測結(jié)果表明,在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū),草莓灰霉病菌對嘧霉胺已產(chǎn)生較高的抗藥性,抗性菌株比例在2011 年和2012 年分別達到77.4%和66.0%。

      表1 江蘇5 個草莓產(chǎn)區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性Table 1 Resistances of B. cinerea from strawberry in 5 regions of Jiangsu to pyrimethanil

      從5 個地點采集的草莓灰霉病菌菌株來看,宜興市宜城區(qū)草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性菌株所占比例最高,2011 年和2012 年抗性菌株所占比例分別為100%(9.1% +39.4% +51.5%)和90.2%(0 +2.0%+88.2%),且絕大多數(shù)菌株為中抗和高抗菌株;東海縣黃川鎮(zhèn)草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗性株比例最小,2011 年和2012 年抗性菌株所占比例分別為55.5%(14.8% +37.0% +3.7%)和43.4% (0 +3.8% +39.6%)(表1)。2 年的檢測結(jié)果表明,草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性有明顯的地域差異,這可能與各地嘧霉胺的使用年限和施藥量有一定的相關(guān)性。

      2.3 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗藥性

      2012 年從江蘇5 個草莓主產(chǎn)區(qū)采集的206 個灰霉病菌菌株,采用最低抑制濃度法(MIC)檢測這些菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的抗藥性。結(jié)果(表2)顯示,在206 個菌株中,抗多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的菌株分別占67.5%、11.2%、63.6%和59.7%,其中灰霉病菌對腐霉利的抗藥性菌株所占比例最小。表明,在江蘇草霉產(chǎn)區(qū),應(yīng)用異菌脲、多菌靈、乙霉威防治灰霉病的防病效果較低,已無實用價值。

      表2 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑的抗藥性Table 2 Resistance of B. cinerea from strawberry to five fungicides

      2.4 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑抗藥性的表現(xiàn)型

      2012 年采集的206 個草莓灰霉病菌菌株,根據(jù)它們對多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威和嘧霉胺這5 種殺菌劑的抗、感性程度,可以分為17 種表現(xiàn)型(表3)。對多菌靈、異菌脲、嘧霉胺表現(xiàn)抗藥性及對腐霉利、乙霉威表現(xiàn)敏感的菌株有63 個,所占比例為30.6%;對多菌靈、異菌脲、嘧霉胺、乙霉威表現(xiàn)抗藥性及僅對腐霉利表現(xiàn)敏感的菌株有45 個,所占比例為21.8%;對乙霉威表現(xiàn)抗藥性及對多菌靈、異菌脲、腐霉利和嘧霉胺表現(xiàn)敏感的菌株有20 個,占9.7%;對多菌靈、腐霉利、異菌脲表現(xiàn)敏感及對乙霉威和嘧霉胺表現(xiàn)抗性的菌株有17 個,占8.3%;對多菌靈、乙霉威、嘧霉胺表現(xiàn)抗藥性及對腐霉利和異菌脲表現(xiàn)敏感的菌株13 個,占6.3%;其他表現(xiàn)型的菌株數(shù)均在10 個以下,所占比例較低。

      表3 草莓灰霉病菌對5 種殺菌劑抗藥性的表現(xiàn)型Table 3 Resistance types of B. cinerea from strawberry to five fungicides

      3 討論

      3.1 草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

      嘧霉胺在蔬菜和草莓上用于防治灰霉病已有十多年,在蔬菜灰霉病菌,特別是番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性已有許多報道[11-12,17-18],而草莓灰霉病菌對嘧霉胺抗藥性研究卻鮮有報道。我們2011 ~2012 年的研究結(jié)果表明,在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū),草莓灰霉病菌對嘧霉胺也產(chǎn)生了較高的抗藥性,2011 年和2012 年抗性菌株的比例分別達到77.4% 和66.0%。表明,生產(chǎn)上應(yīng)用嘧霉胺防治草莓灰霉病的防治效果較低,應(yīng)篩選新的殺菌劑用于草莓灰霉病的防治。

      3.2 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威的抗藥性

      2012 年我們應(yīng)用MIC 法測定了206 個草莓灰霉病菌菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉胺的抗藥性,結(jié)果表明抗多菌靈、腐霉利、異菌脲和乙霉威的菌株分別占67.5%、11.2%、63.6% 和59.7%。表明,在江蘇草莓主產(chǎn)區(qū),草莓灰霉病菌對多菌靈、異菌脲、乙霉威均產(chǎn)生了較高的抗藥性,應(yīng)用這3 種藥劑防治草莓灰霉病意義不大。

      3.3 殺菌劑的交互抗藥性

      據(jù)報道,乙霉威與多菌靈存在負交互抗性[19]。本檢測結(jié)果表明,在166 個抗多菌靈的菌株中,74個菌株對乙霉威仍表現(xiàn)抗性,92 個對乙霉威表現(xiàn)敏感。這可能與灰霉病菌對多菌靈抗性的突變位點不同有關(guān)[20]。異菌脲和腐霉利同屬于二甲酰亞胺類殺菌劑,其作用機理可能是通過滲透壓傳導途徑發(fā)揮抑菌作用,這2 種殺菌劑間存在交互抗性[13]。在本試驗檢測的206 個菌株中,對異菌脲和腐霉利均表現(xiàn)敏感的有71 個菌株;對這2 種殺菌劑均表現(xiàn)抗性的有20 個菌株;而對異菌脲表現(xiàn)抗性及對腐霉利表現(xiàn)敏感的有112 個菌株;對異菌脲表現(xiàn)敏感及對腐霉利表現(xiàn)抗性的有3 個菌株。表明,草莓灰霉病菌對同屬二甲酰亞胺類的殺菌劑并不完全表現(xiàn)交互抗藥性,其機理還有待進一步研究。

      3.4 草莓灰霉病菌對殺菌劑的多重抗藥性

      草莓灰霉病菌對多菌靈、乙霉威、腐霉利、異菌脲的室內(nèi)誘變抗性菌株和田間抗性菌株報道較多[7-10],對多菌靈和乙霉威[10]、多菌靈和異菌脲[21]、多菌靈和腐霉利[22]的雙抗菌株也有報道,而對多種殺菌劑的多重抗性菌株的報道還較少。我們2012年測定206 個草莓灰霉病菌菌株對多菌靈、乙霉威、腐霉利、異菌脲和嘧霉胺抗藥性,沒有檢測到對這5種殺菌劑均敏感的野生菌株;對這5 種殺菌劑均表現(xiàn)抗性的多重抗性菌株6 個,占2.9%;4 重抗性菌株61 個,占29.6%;3 重抗性菌株77 個,占37.4%;雙重抗性菌株34 個,占16.5%;單抗菌株28 個,占13.6%。原因可能是草莓灰霉病防治中,所使用殺菌劑種類較多,田間出現(xiàn)多重抗性的菌株比例上升。

      3.5 防治草莓灰霉病新殺菌劑的篩選

      本研究結(jié)果表明草莓灰霉病菌對目前生產(chǎn)應(yīng)用的5 種殺菌劑均產(chǎn)生了抗藥性,這是近年來這些藥劑對草莓灰霉病防治效果下降的主要原因。許多研究者也在篩選新殺菌劑用于草莓灰霉病的防治,如啶酰菌胺(Boscalid)、咯菌腈(Fludioxonil)對草莓灰霉病菌具有較高的毒力和較好的田間防病效果[23-25];嘧菌環(huán)胺(Cyprodinil)對葡萄灰霉病菌具有較高抑菌活性和田間防病效果[26],嘧菌環(huán)胺抑制123 個草莓灰霉病菌菌株菌絲生長的平均EC50值為(0.028 3 ±0.005 3)μg/ml。這些新殺菌劑在草莓灰霉病防治中的應(yīng)用,首先要考慮這些新殺菌劑與目前生產(chǎn)上應(yīng)用的殺菌劑是否存在交互抗性,以及這些新藥劑的抗藥性風險。

      植物病原菌對殺菌劑的抗性風險是由藥劑和病菌共同決定的,如藥劑的選擇壓力和作用機制、病菌自身的抗藥性頻率、抗藥性突變體的適合度和交互抗性等[27]。在沒有明確草莓灰霉病菌對這些新殺菌劑抗性風險情況下,在應(yīng)用中應(yīng)該遵循殺菌劑使用準則,與其他不同作用機制的殺菌劑輪換使用或交替使用,以延緩病菌抗藥性的產(chǎn)生。

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