牛凌梅，張玉娜，連靠奇，石紅梅，康維鈞*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北石家莊050017）

（2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊050011）

基于雙層納米金修飾傳感器的應(yīng)用研究

牛凌梅1，張玉娜2，連靠奇1，石紅梅1，康維鈞1*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北石家莊050017）

（2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊050011）

制備了由聚番紅花紅和DNA固定的雙層三維分布的納米金修飾的玻碳電極，在此基礎(chǔ)上研究了多巴胺（DA）在此修飾電極上的電化學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)對(duì)DA的氧化，雙層納米金比單層的納米金修飾的玻碳電極更能夠起到明顯的電催化作用。利用差分脈沖法（DPV）考察了DA測(cè)定的優(yōu)化條件，并發(fā)現(xiàn)其濃度在1.0×10-8～1.0×10-6mol/L范圍內(nèi)與峰電流呈良好的線性關(guān)系。該電極用于實(shí)際樣品的測(cè)定，結(jié)果滿意。

納米金；玻碳電極；多巴胺

0 引言

多巴胺（DA）是存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),它濃度異常時(shí)可導(dǎo)致多種疾病，例如帕金森氏病和精神分裂癥[1]。因此，能夠快速、靈敏的測(cè)定多巴胺具有重要的實(shí)際意義。已報(bào)道測(cè)定多巴胺的方法有很多，例如光譜法[2]，質(zhì)譜法[3]，熒光法[4]，化學(xué)發(fā)光法[5]，毛細(xì)管電泳法[6]，色譜法[7]，以及電化學(xué)方法[1,8~9]等。該文則利用番紅花紅聚合膜和DNA來(lái)固定雙層納米金(GNPs)，呈三維分布的納米金修飾的玻碳電極來(lái)測(cè)定多巴胺，建立了定量測(cè)定多巴胺的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

番紅花紅 （SFR）購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑有限公司；DA（Fluka公司）儲(chǔ)備液：0.01 mol/L；氯金酸購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；DNA（1 mg/mL）購(gòu)于Sigma公司以50 mmol/L tris-HCl(pH7.00)和20 mmol/L NaCl溶解，4℃儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)中使用二次水，其它試劑均為分析純。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行（約為25℃）

1.2 儀器

CHI850C（上海辰華儀器有限公司）；電極采用三電極系統(tǒng)：鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，工作電極為裸玻碳電極（GCE）或納米金修飾的玻碳電極。所有電位均相對(duì)于Ag/AgCl參比電極而言。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金修飾電極的制備

將裸玻碳電極置于Al2O3粉末的懸漿之中進(jìn)行打磨至鏡面，取出，依次用1∶1的HNO3、1∶1的丙酮、二次蒸餾水，各超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈?。參照文獻(xiàn)[10]，將聚番紅花紅修飾好的電極（poly (SFR)/GCE）浸入到納米金溶液中10 h，取出，用蒸餾水沖洗干凈，得到單層納米金修飾電極（GN/ poly(SFR)/GCE）。再將此電極浸入DNA(1mg/mL)溶液中2 h，取出，沖洗干凈，即為DNA納米金修飾電極（DNA/GN/poly(SFR)/GCE）。最后，將此修飾電極再次浸入到納米金溶液中2 h，取出，即可制得雙層三維分布的納米金修飾傳感器（GN/ DNA/GN/poly(SFR)/GCE）。

2.2 DA在GN/DNA/GN/poly(SFR)/GCE上的電化學(xué)響應(yīng)

圖1 裸玻碳電極（a）與GN/DNA/GN/poly(SFR)/GCE（b, c）在DA（a，b）及空白溶液（c）中的差分脈沖伏安曲線；DA濃度：3.0×10-7mol/L；pH6.0Fig.1 DPVs at bare GC electrode(a)and GN/DNA/GN/ poly(SFR)/GCE(b,c)in the presence(a，b)and absence(c) of DA solution;Concentration:3.0×10-7mol/L;pH6.0

利用差分脈沖法研究了DA在裸玻碳及修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)。由圖1可以看出，在裸玻碳電極（a）表面，DA的氧化峰電流為3.193×10-7A。而在雙層納米金修飾的玻碳電極（b）表面，DA的峰電流卻大大增加（1.318×10-6A），說(shuō)明在修飾電極表面，DA的氧化變得更加容易。這可能是由于納米金是電子的良導(dǎo)體，能夠加速電子的傳遞，從而使得峰電流大大提高。

2.3 各層修飾膜浸泡時(shí)間對(duì)DA測(cè)定的影響

圖2 各層修飾膜浸泡時(shí)間對(duì)DA測(cè)定的影響；a：第一層納米金膜；b：DNA修飾膜；c：第二層納米金膜；DA濃度：4.0×10-7mol/LFig.2 Effect of accumulation time of each layer on the determination of DA;a:the first layer of GNPs;b:DNA monolayer;c:the second layer of GNPs;DA concentration: 4.0×10-7mol/L

實(shí)驗(yàn)中研究了各層修飾膜對(duì)DA測(cè)定的影響。如圖2（a）所示，隨著在納米金溶液中浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，所吸附的納米金亦隨之增加。結(jié)果，由于修飾電極對(duì)DA的氧化能力逐漸增加而導(dǎo)致了DA在此修飾電極上的氧化電流也隨之增大。但當(dāng)時(shí)間超過(guò)10 h后，氧化電流趨于平緩（2.2×10-6A），說(shuō)明吸附的納米金已趨于飽和。因此，選用10 h作為第一次納米金的浸泡時(shí)間。但由于DNA對(duì)DA的氧化沒(méi)有電催化能力，故隨著在DNA中浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，DA的氧化峰電流隨之降低，如圖2（b）所示。在浸泡2 h后，DNA吸附達(dá)到了飽和，因此選用2 h作為DNA的浸泡時(shí)間。雖然此時(shí)DNA修飾的電極有最低的電催化活性，但它卻可以吸附最多的納米金。隨著再次浸入納米金溶液時(shí)間的延長(zhǎng)，DA的氧化峰電流又繼續(xù)上升，直至浸泡2 h后趨于飽和，從而達(dá)到DA的最大氧化峰電流（3.5×10-6A）（圖2（c））。相對(duì)于單層納米金修飾的電極，其電流增長(zhǎng)了59%。

2.4 溶液pH值對(duì)DA測(cè)定的影響

在不同pH值的磷酸緩沖溶液中研究了支持電解質(zhì)對(duì)DA測(cè)定的影響（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DA的氧化峰隨著溶液pH值的增加而逐漸增加，并在pH6.0處達(dá)到最大值，之后逐漸減小。這可能是因?yàn)镈A（pKa=8.9）在pH小于8.9時(shí)呈質(zhì)子化狀態(tài)，且隨著pH的減小，與帶負(fù)電的納米金粒子之間的靜電作用力亦隨之增加。但當(dāng)pH小于6.0時(shí)，由于DA的不穩(wěn)定性而使得濃度減少?gòu)亩鴮?dǎo)致峰電流降低。故該實(shí)驗(yàn)中選用pH6.0緩沖溶液作為支持電解質(zhì)。

圖3 不同pH緩沖溶液對(duì)于DA測(cè)定的影響DA：4.0×10-7mol/LFig.3 Effect of pH on the determination of DA. Concentration of DA:4.0×10-7mol/L

2.5 分析應(yīng)用

利用差分脈沖法 （DPV）研究了DA在GN/ DNA/GN/poly(SFR)修飾電極上的線性關(guān)系（圖4）。發(fā)現(xiàn)DA的氧化峰電流在1.0×10-8mol/L~ 1.0×10-6mol/L范圍內(nèi)均隨著其濃度的增加而線性增加，檢出限達(dá)到6.0×10-9mol/L。其線性方程為ip=1.134 0+3.490 4c(r:0.995 1,c:10-7mol/L，ip：10-7A)。利用此電極對(duì)多巴胺注射（1.00 mg/mL）中的DA進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如表1中所示。根據(jù)測(cè)定結(jié)果可得樣品中多巴胺的含量為0.99 mg/mL。

表1 針劑樣品中不同濃度多巴胺的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results for the determination of DA in injection

2.6 納米金修飾電極的穩(wěn)定性

在3.0×10-7mol/L的DA溶液中考察了納米金修飾電極的穩(wěn)定性。20次連續(xù)測(cè)定之后，DA峰電流的改變?cè)?%之內(nèi)，將此修飾電極置于磷酸緩沖溶液（pH7.0）中60 d后，仍保留90%的電催化活性。以上結(jié)果均表明此修飾電極有著很好的穩(wěn)定性。

2.7 干擾物測(cè)定

研究了各種干擾物對(duì)濃度為3.0×10-7mol/L DA測(cè)定的影響。在相對(duì)誤差5%的限度之內(nèi)，500倍的Na+、Cl-、K+、Mg2+、Ca2+，50倍的L-賴氨酸、葡萄糖、L-天門(mén)冬酰胺，20倍的谷氨酸、甘氨酸、胱氨酸、NADH對(duì)于測(cè)定不產(chǎn)生干擾，說(shuō)明此修飾電極有很好的選擇性。

圖4 DA不同濃度的差分脈沖曲線DA濃度（10-7mol/L）：(1)0.2(2)0.3(3)0.4(4)0.5(5)0.6 (6)0.7(7)0.8(8)0.9(9)1.0(10)2.0(11)3.0(12)4.0(13) 5.0(14)6.0(15)7.0(16)8.0(17)9.0(18)10.0Fig.4 DPVs of DA at different concentrations Concentration of DA(10-7mol/L):(1)0.2(2)0.3(3)0.4(4) 0.5(5)0.6(6)0.7(7)0.8(8)0.9(9)1.0(10)2.0(11)3.0 (12)4.0(13)5.0(14)6.0(15)7.0(16)8.0(17)9.0(18)10.0

[1]Zhao H,Zhang Y,Yuan Z.Study on the electrochemical behavior of dopamine with poly(sulfosalicylic acid)modified glassy carbon electrode[J].Anal.Chim.Acta., 2001,441(1):117~122.

[2]Mariusz M,Ma??gorzata O,Micha?? C,et al.Spectrophotometric determination of dopamine in microliter scale using microfluidic system based on polymeric technology[J].Anal.Chim.Acta.,2005,540(1):153~157.

[3]Michotte Y,Deleu D,Ebinger G.The use of capillary gas chromatography/mass spectrometry for the determination of acidic dopamine metabolites in human brain[J].Biological.Mass.Spectro.,1985,12(12):704~706.

[4]Wang H Y,Sun Y,Tang B.Study on fluorescence property of dopamine and determination of dopamine by fluorimetry[J].Talanta.,2002,57(5):899~907.

[5]Edyta N,Rosa R B,Anatol K.Determination of dopamine by flow-injection analysis coupled with luminol-hexacyanoferrate(Ⅲ)chemiluminescence detection[J].J. Pharm.Biomed.Anal.,2004,36(1):219~223.

[6]Xu X.Analysis of selected dopamine receptor antagonists in serum using capillary electrophoresis with cyclodextrin additives[J].J.Pharm.Biomed.Anal.,2000,23(4):735~ 743.

[7]Huang H M,Lin C H.Methanol plug assisted sweepingmicellar electrokinetic chromatography for the determination of dopamine in urine by violet light emitting diode-induced fluorescence detection[J].J.Chromatogr. B.,2005,816(1-2):113~119.

[8]Razmi H,Azadbakht A.Electrochemical characteristics of dopamine oxidation at palladium hexacyanoferrate film,electroless plated on aluminum electrode[J].Electrochim.Acta.,2005,50(11):2 193~2 201.

[9]Ghitaa M,Arrigan D W M.Dopamine voltammetry at overoxidised polyindole electrodes[J].Electrochim.Acta.,2004,49(26):4 743~4 751.

[10]Niu L M,Lian K Q,Kang W J,et al.Characterization of Poly(Safranine T)-Modified Electrode and Application for Simultaneous Determination of Epinephrine and Uric Acid Coexisting with Ascorbic Acid[J].J.Braz.Chem. Soc.,2011,22(2):204~210.

Study of biosensor and application of double layer of gold nanoparticles modified glassy carbon electrode

Niu Ling-mei1,Zhang Yu-na2,Lian Kao-qi1,Shi Hong-mei1,Kang Wei-jun1*
(1.School of Public Health,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China）
(2.Division of endocrinology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China)

The three-dimensional distributed gold nanaoparticles(GNPs),which were anchored with poly(safranine T)and DNA,modified electrode was prepared.Based on the above,the electrochemical behavior of dopamine(DA) at this modified electrode was investigated.It was found that the double layer of GNPs modified electrode shows a better electrocatalytic activity for the oxidation of DA than that at single layer of GNPs.The optimum conditions of DA determination were studied by differential pulse voltammetry(DPV)and it was found that the linear relationship between peak current and concentration was in the linear range of 1.0×10-8～1.0×10-6mol/L.The modified electrode can be applied to the determination of DA in the practical injection samples with satisfactory results.

gold nanoparticles;glassy carbon electrode;dopamine

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81172722，81273128）項(xiàng)目資助

*通訊聯(lián)系人,E-mail:kangwj158@hotmail.com，Tel：0311-86261043