王志華 張普 朱偉 張慶勇，＊

心肌微血管結構和功能變化在心血管疾病如冠心病、高血壓和糖尿病心肌病病變過程中發(fā)揮著重要作用［1，2］。心肌微血管的新生是心肌細胞種植、心肌重塑成功與否的關鍵，因此，建立有效的心肌微血管內皮細胞（MMVECs）體外培養(yǎng)體系能為進一步深入研究心血管相關疾病的發(fā)病機理及治療提供重要的細胞模型。由于心肌微血管段分離步驟復雜，所用培養(yǎng)方法如灌注法、酶消化法等存在一些問題，使獲得的內皮細胞量較少，純度也不高。故目前的相關體外研究多采用容易得到的大血管內皮細胞，如人臍靜脈內皮細胞或主動脈內皮細胞等。但是，血管內皮細胞具有明顯的器官特異性和組織特異性［3］，利用大血管內皮細胞研究的結果很難客觀、準確地解釋MVECs病變［4］。本研究以文獻報道的貼塊法為基礎［5，6］，通過心肌組織貼塊法和培養(yǎng)液中加用肝素的方法建立了簡單、快速、可靠，且可獲得高純度MMVECs的體外培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

倒置顯微鏡、倒置分光熒光顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)（Leica，德國）、CO2細胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 動物和試劑

選用6～8周齡Wistar雄性大鼠（約60～100g）（上海斯萊克實驗動物中心）。DMEM 高糖培養(yǎng)基（Invitrogen，美國）；鼠尾膠（自制）；胰蛋白酶（1∶250，Ameresco，美國）；胎牛血清（FBS，Gibco，美國）；兔抗鼠CD34單克隆抗體、兔抗鼠CD31單克隆抗體（Antibody Diagnostica Inc，美國）；兔抗人VIII因子相關抗原多克隆抗體（DAKO，丹麥）；抗兔及抗鼠ABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、FITC 標記羊抗兔IgG（Beyotime，中國）；其余化學試劑為國產分析純商品。

1.3 實驗用肝素的配制

市售肝素鈉注射液（12500U，1ml／安瓿，批號：H32020612，萬邦醫(yī)藥，江蘇）加入24ml生理鹽水中，用0.22μm 針頭濾器抽濾，即成500U／ml的母液。使用前加入適量20%FBS DMEM 高糖培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中肝素濃度為20U／ml。

1.4 植塊法培養(yǎng)大鼠MMVECs

Wistar大鼠3～5只，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，再腹腔內注射200U 肝素。將大鼠于75%乙醇浸泡消毒30min后移至超凈工作臺進行操作：逐層打開胸腔，暴露心臟，剪開心包，由升主動脈處剪下心臟，放入PBS緩沖液中，將心腔中的血液沖洗干凈，辨清心臟解剖結構，去除大血管、左右心房以及右心室和室間隔，保留左心室，小心去除心內膜及心外膜，用眼科剪將心室肌剪成若干大小約2mm3小塊，均勻接種于鼠尾膠預處理過的培養(yǎng)皿中，組織塊間隔1～3mm，滴加少許FBS，置37℃、5%CO2細胞孵育箱靜置培養(yǎng)，使其貼壁；約40min后加入5ml含20%FBS DMEM 高糖培養(yǎng)液；約48h后用倒置顯微鏡觀察，若組織塊周圍有細胞長出，則更換一半上述培養(yǎng)液，約70h去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)36h。待細胞生長至鋪滿皿底80%～90%后，用含0.125%胰蛋白酶消化細胞進行傳代。選取第二代細胞進行鑒定。

1.5 MMVECs鑒定

采用免疫組織化學和免疫熒光染色法對MMVECs進行鑒定。CD31和CD34分別參照抗兔及抗鼠ABC試劑盒說明書操作，細胞和細胞核染成棕褐色為陽性；VIII因子抗體采用FITC標記，胞漿呈紅色熒光；實驗中用PBS作陰性對照?？贵w稀釋比例：CD34、CD31為1∶500，VIII因子為1∶200。

2 結果

2.1 培養(yǎng)MMVECs形態(tài)學觀察

采用心肌組織塊貼壁培養(yǎng)約48h 可見到MMVECs從組織塊周圍爬出，約70h 可見到組織塊周圍MMVECs明顯增多，組織塊之間內皮細胞可連接成片。去除組織塊后約36h，MMVECs可以生長融合至80%～90%，呈典型鋪路石樣形態(tài)。見圖1。

2.2 培養(yǎng)MMVECs鑒定

CD31染色顯示所有MMVECs均染成棕褐色，細胞輪廓清晰。CD34染色顯示細胞核染成棕褐色，以核周胞漿最為明顯。VIII因子相關抗原染色顯示胞漿呈紅色熒光，以核周胞漿最明顯。用PBS代替一抗染色的細胞未見特異性顯色，為陰性反應。證實培養(yǎng)的MMVECs純度很高。見圖2。

［本文圖1、圖2見封4］

3 討論

目前分離培養(yǎng)MVECs以酶消化法常用，因為該方法獲得的內皮細胞生長快，數(shù)量多，純度高。但是酶消化法也存在一些缺點：（1）消化酶價格較貴。（2）在消化過程中如何掌握酶的濃度和消化時間難度較大。酶濃度過高或消化時間過長，細胞從血管段脫落后被消化破壞而死亡，沒有被消化破壞的細胞貼壁差，生長慢；而酶濃度過低或消化時間過短，則分離效果差，獲得的MVECs數(shù)量少。本研究采用改良貼塊法培養(yǎng)MVECs，主要創(chuàng)新在于：（1）腹腔內注射肝素使貼塊后游出的血細胞不發(fā)生凝固而堵塞微血管，以利MVECs生長。筆者預實驗時發(fā)現(xiàn)，在貼塊培養(yǎng)過程中，血細胞首先游出，過多游出的血細胞既妨礙MVECs生長，又容易阻塞微血管，也妨礙MVECs 游出；腹腔內注射肝素還有利于PBS對組織塊的徹底清洗，清除血細胞的影響。（2）培養(yǎng)液中加入肝素可促進MVECs生長及提高其純度。應用貼塊法獲得更多MVECs的方法通常是延長去組織塊的時間，這樣就會存在成纖維細胞生長影響MVECs純度的風險。通過在培養(yǎng)液中加入適量肝素，縮短去組織塊時間，可顯著提高MVECs的純度，這與肝素本身可能有促進MVECs生長，以及細胞培養(yǎng)過程中產生多種生長因子與肝素結合而共同促進MVECs生長［7］有關。

MVECs一般呈單層生長，呈多邊形或梭形，有接觸抑制現(xiàn)象，細胞密度較高時呈鋪路石樣生長，電鏡下可以看到Weibel-Palade小體。CD31和VIII因子相關抗原是內皮細胞的標志物，尤其后者為內皮細胞所特有，MVECs除了表達VIII因子和CD31外，還可表達MVECs的特異性分子標志CD34［4］。本研究從心肌組織培養(yǎng)的MVECs表現(xiàn)出典型的單層鵝卵石樣排列［5］；通過免疫組化和免疫熒光染色表明，MMVECs 能明顯表達VIII因子、CD31和CD34［8、9］，證明通過改良貼塊法所獲得的細胞確實是MVECs，而且純度很高。

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