陳秀華，王臻昱，李先平，朱延明，劉 麗，陳 威，陳 勤,6*

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，昆明 650205；2.云南田瑞種業(yè)有限公司，昆明 650205；3.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；4.中國科學院東北地理與生態(tài)研究所，哈爾濱 150081；5.云南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，昆明 650205；6.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部萊斯布里奇研究中心，加拿大 艾伯塔省 萊斯布里奇 T1J4B1）

植物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases，GSTs，EC 2.5.1.18）是一類普遍存在的，由一個龐大而復雜的基因家族所編碼，具有多種生物學功能的一組同工酶。這類酶用于催化谷胱甘肽與有毒異源物或氧化產(chǎn)物結(jié)合，從而促進此類物質(zhì)的代謝、區(qū)域化隔離或清除。根據(jù)序列相似性可將其分為三種類型（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）[1]，Ⅰ型包括具有除草劑解毒活性的GSTs，這類基因均包括3個外顯子；Ⅲ型為植物激素誘導的GSTs，包括兩個外顯子；Ⅱ型有10個外顯子，與哺乳動物的zeta GSTs相近。有學者建議將擬南芥中類似于哺乳動物theta GSTs劃分為Ⅳ型[2]。另有將其分為八種亞類，其中 phi，tau，theta，zeta，lambda 和DHAR（Dehydroascorbate reductase，谷胱甘肽依賴的抗壞血酸還原酶）和TCHQD（Tetrachlorohydroquinone dehalogenase，四氯代氫醌脫鹵素酶）亞類為可溶性GSTs，可溶性的植物谷胱甘肽還原酶也是本文主要探討的內(nèi)容。另一個亞類為微粒體的GSTs[3]，它和主要的GST超家族關系不大，但是具有相似的谷胱甘肽依賴的活性，在谷胱甘肽代謝中是一種膜關聯(lián)蛋白。動物上也有theta和zeta相似結(jié)構(gòu)的GSTs，其余結(jié)構(gòu)均為植物所特有[4]?；蚍治龊椭参锘蚪M工程表明，GSTs由超過40種基因編碼，而這些編碼蛋白僅有10%的序列相似性[5]。大豆中有25個GSTs基因，玉米中有42個[5]，而擬南芥中有48個該基因家族成員，其中tau和phi最為豐富。GSTs對于細胞異源物質(zhì)的清除，細胞解毒作用，以及提高植物對非生物脅迫的耐受具有重要作用。

1 GSTs的結(jié)構(gòu)

可溶性GST是分子質(zhì)量為50 ku二聚體疏水蛋白[4]，每個亞基大小為23～30 ku。目前，已了解結(jié)構(gòu)信息的植物GSTs包括擬南芥phi和zeta亞類、小麥、水稻GST1（OsGSTU1）和玉米的tau亞類。

GSTs基因的序列相似性較低，但通過對大量GST蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)GST蛋白結(jié)構(gòu)具有高度保守性。每個亞單元包括兩個不同的域，N末端和C末端是由一個α螺旋連接的分別為βαβ和ββα結(jié)構(gòu)的不同基序。大部分胞液GSTs以同質(zhì)或異質(zhì)二聚體亞基形式發(fā)揮酶活性。植物中唯一有活性的GSTs單體是擬南芥lambda和DHARs[6]。對于phi和tau亞基來說，只有同一類型的亞基才能二聚化。在重組細菌中共表達GSTs亞基顯示二聚體化是自發(fā)的，但這種自發(fā)性僅限同類亞基[7]。玉米tau GSTs ZmGSTⅤ和ZmGSTⅥ亞基形成異源二聚體和同源二聚體的可能性是相同的，然而phi GSTs ZmGSTⅠ和ZmGSTⅡ亞基更傾向于形成異源二聚體[7]。

X射線晶體衍射顯示擬南芥和玉米的三個phi類GSTs有相似的三維拓撲結(jié)構(gòu)，但卻僅有20%的序列相同。每個亞基N末端域均有保守的結(jié)合谷胱甘肽的G位點，C末端的H位點為谷胱甘肽的結(jié)合提供一個高度保守的天冬氨酸殘基和能夠與疏水配體結(jié)合的大部分殘基[8]。G位點是接納GSH的特異部位，并且該位點能促成有催化活性的谷胱甘肽硫負離子形成。在三個phi GSTs中，活性部位位于兩個亞基構(gòu)成的大開口裂縫的其中一個側(cè)面上，平面和球形的大分子可以通過，而且每個活性位點和鄰近亞基有較輕微相互作用[9]。

2 GSTs的功能

2.1 解毒功能

GSTs最重要的一個功能就是失活有毒化合物的能力。異源物質(zhì)在植物體內(nèi)的代謝主要分為三個階段：階段Ⅰ（轉(zhuǎn)化）、階段Ⅱ（結(jié)合）和階段Ⅲ（區(qū)域化）[10]。GSTs能催化谷胱甘肽中巰基基團對不同親電分子進行親核攻擊，使外源性化合物與內(nèi)源的還原谷胱甘肽（GSH）發(fā)生結(jié)合反應[11]。許多外源化學物在生物轉(zhuǎn)化階段I中極易形成某些生物活性中間產(chǎn)物，它們可與細胞生物大分子重要成分發(fā)生共價結(jié)合，對機體造成損害。谷胱甘肽與其結(jié)合后，可防止此種共價結(jié)合的發(fā)生。

2.2 跨膜運輸定位

在植物中，很多次生代謝物對植物，甚至對產(chǎn)生它們的細胞都是有毒的。因此，將它們定位到合適部位（通常為液泡）很關鍵。谷胱甘肽泵能夠識別與GSH結(jié)合而標記的內(nèi)源底物和異源物質(zhì)。在酶的作用下，ATP依賴的膜泵能夠識別和轉(zhuǎn)運軛合物跨膜排泄或隔離?；ㄇ嗨匦枰cGSH結(jié)合才能轉(zhuǎn)運到液泡中[10]。色素在胞液中不當?shù)臏舨坏璧K色素形成，而且會對細胞產(chǎn)生毒性[12]。

2.3 保護細胞免受氧化損失

羥自由基起始的氧化損傷內(nèi)源產(chǎn)物具有很高的細胞毒性。包括膜脂過氧化物和DNA氧化降解產(chǎn)物等。GSTs使GSH和這種內(nèi)源的親電體結(jié)合已達到脫毒的作用。某些GSTs也作為谷胱甘肽過氧化物酶直接發(fā)揮脫毒作用[13]。

2.4 配體蛋白：非酶結(jié)合和胞內(nèi)運輸

GSTs還可能作為配體蛋白起作用。作為非底物配體的化合物，它們與GSTs綁定的位點與酶催化位點不同。植物中某些GSTs作為天然植物激素IAA的載體發(fā)揮作用。它們之間會形成植物激素結(jié)合蛋白而不是IAA-GSH共軛物。擬南芥GSTs Atpm24.1能夠綁定光親和的IAA類似物。但是這個酶卻不能將GSH結(jié)合到IAA上，所以認為IAA類似物可能結(jié)合在距離活性中心較遠的另一個結(jié)合位點上，結(jié)合方式與類固醇和卟啉衍生物類似[14]。這種非酶綁定可能允許IAA的臨時儲存和IAA活性、通過細胞膜的攝入和運輸?shù)绞荏w的調(diào)控。GSTs配體蛋白的功能可能與預防分子在膜上或細胞內(nèi)的過度積累導致的細胞毒性有關。

3 植物GSTs研究進展

GSTs不僅在正常細胞代謝和異質(zhì)化合物的解毒方面均發(fā)揮著重要作用，對提高植物耐受不良環(huán)境條件、抵抗損傷等方面同樣起重要作用。多種作物中的GSTs能夠受到多種不同環(huán)境刺激誘導，如真菌攻擊、干旱脅迫、乙烯和傷口等[1]。

大豆中GH2/4（也稱為Gmhsp26-A）基因分別作為熱激蛋白和植物激素誘導蛋白被獨立克隆。通過分析這個蛋白與其他GSTs同源性和促使GSH和模式 底 物 CDNB（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，1-氯-2，4-二硝基苯）發(fā)生結(jié)合的作用，確認它為GST。除熱激和植物激素，包括ABA（Abscisic acid，脫落酸）、KT（Kinetin，激動素）、GA3（Gibberellic acid，赤霉素）、 PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇）、KCl、NaF和重金屬等一系列化學物質(zhì)均能誘導GH2/4信使[5]。

3.1 GST降低異源物質(zhì)毒性研究

最早發(fā)現(xiàn)的植物GSTs的功能即為它能代謝除草劑轉(zhuǎn)變?yōu)榉嵌拘问?。已發(fā)現(xiàn)幾種主要的除草劑都能被GSH結(jié)合，而這種結(jié)合不會傷害目的酶。

高等植物中，還原型谷胱甘肽（GSH）和GSTs在降解某些異源物質(zhì)中起到非常關鍵的作用?？扇苄缘腉STs介導GSH或其同系物與除草劑發(fā)生結(jié)合反應而引發(fā)其降解[15]。Xu等用乙草胺處理小米、高粱和玉米幾種作物幼苗以誘導GSH和GSTs，當處理濃度不同時，硫醇含量和GSTs活性先隨著處理濃度升高而升高，達到頂峰時開始下降，且這種趨勢在這幾種不同作物上的表現(xiàn)是相同的[16]。誘導的GST活性程度和硫醇含量與不同作物對乙草胺的抗性程度相關，因此推測內(nèi)源的GSH庫水平和GSTs活性與作物抵抗外源有毒物質(zhì)的保護機制密切相關。May等也認為GSH的含量水平對植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫反應能力十分重要[17]，結(jié)合反應導致細胞內(nèi)GSH含量突然降低。當體內(nèi)GSH消耗過多時，胞質(zhì)中GSH庫含量的恢復速度可能影響植物抵抗脅迫的能力和對除草劑的耐受性[17]。

玉米GSTIV可以響應安全劑和一系列除草劑的脅迫。安全劑就是通過激活GST基因來加快植物體內(nèi)除草劑代謝的[18]。

3.2 GSTs在植物非生物脅迫中的作用

先前的研究表明植物GSTs基因可以響應多種非生物脅迫，包括脫水、UV、冷害、干旱、高鹽和ABA[19]。表明GSTs基因在植物抵抗非生物脅迫反應中發(fā)揮著重要作用。

3.2.1 低溫

在煙草中超量表達一種同時編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性酶的cDNA，其GST和GPX活性均較野生型高出兩倍。在寒冷脅迫條件下這些GST/GPX超量表達的煙草幼苗的生長速度顯著高于對照。冷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草中氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量顯著高于野生型，用GSSG處理野生型幼苗可加速其生長，而用還原型的谷胱甘肽或用其他巰基還原劑處理野生型幼苗則會抑制其生長。因此，超量表達GST/GPX可加速轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在冷脅迫條件下的生長，而這種現(xiàn)象可能是谷胱甘肽庫中氧化型谷胱甘肽含量高造成的[20]。

Huang等從鱗翅目云杉蚜蟲—云杉卷葉蛾中克隆得到一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，并將其轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中[21]。分別將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥置于4和10℃條件下48 h研究其對于低溫的耐受作用。在4和10℃處理48 h后，檢測到轉(zhuǎn)基因擬南芥的GST活性分別高于野生型46.6%和35.7%，轉(zhuǎn)基因擬南芥相對膜透性和丙二醛含量均高于野生型，而葉綠素含量和脯氨酸含量均低于野生型。轉(zhuǎn)基因擬南芥在0℃處理24 h成活率為43.7%，而野生型成活率僅為28.3%。結(jié)果表明插入GST基因可增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性。在水稻中表達鹽地堿蓬的GST或共表達GST和CAT1（Catalase 1，過氧化氫酶1）基因，低溫處理后，轉(zhuǎn)基因植株的GST和CAT活性及PSⅡ最大光化學效率都比未轉(zhuǎn)入這兩種基因的對照高；細胞膜透性及H2O2和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量則低于對照。說明GST和GST+CAT1基因在轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的表達能夠提高其對低溫的抗性[22]。

3.2.2 干旱

植物生長和產(chǎn)量受到多種非生物脅迫因子的負向影響。George等應用耐干旱的葇荑牧豆樹作為模式植物體系用于開發(fā)非生物脅迫耐受基因的功能[23]。用干旱脅迫2月齡的葇荑牧豆樹的葉片建立cDNA文庫，通過對該文庫進行大規(guī)模的隨機EST測序，鑒定出三個不同的由生長素誘導的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶。PjGSTU1是其中的一個定位于線粒體，并可提高轉(zhuǎn)基因煙草干旱耐受能力的GST基因。在大腸桿菌中超量表達PjGSTU1，重組菌種PjGSTU1蛋白是由一個功能性的同源二聚體構(gòu)成的，具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。轉(zhuǎn)PjGSTU1基因煙草株系在15%PEG脅迫下較非轉(zhuǎn)基因煙草生長良好。GFP融合技術表明PjGSTU1蛋白定位于轉(zhuǎn)基因煙草的線粒體中。PjGSTU1的過氧化物酶活性和定位于線粒體說明該基因可能對于活性氧的清除起作用。

3.2.3 耐鹽

存在于土壤和灌溉水中的滲透脅迫物質(zhì)，離子毒性物質(zhì)和高鹽，特別是Na+和Cl-嚴重損害植物生長，鹽害是作物減產(chǎn)的主要因素之一[24]。

Roxas等在煙草中超量表達一種同時編碼GST和GPX活性酶的cDNA，在鹽脅迫條件下這些GST/GPX超量表達的煙草幼苗的生長速度顯著高于對照[20]。將克隆于鹽地堿蓬中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化擬南芥，通過對鹽脅迫下野生型植株（WY）和T3代純合子轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（GT）的生物量和谷胱甘肽（氧化型：GSSG；還原型：GSH）含量測量發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因植株的生物量和GSSG含量在轉(zhuǎn)基因品系中比野生型的含量均高。試驗表明，GST基因的過量表達能夠提高轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫條件下的生長，這種結(jié)果也可能是通過氧化還原型谷胱甘肽來實現(xiàn)的[25]。

4 展望

植物對干旱、鹽堿及低溫耐性的強弱不只由某一個因子決定，其性狀受眾因子的共同影響。這種抵抗非生物脅迫復雜的機制加大了采用基因工程方法有效改良植物脅迫耐性的困難程度。通過分子育種導入或改良個別功能基因?qū)μ岣咧参锟鼓嫘杂邢?，難以滿足生產(chǎn)需要，即使進行多基因的聯(lián)合導入，各基因間的相互協(xié)調(diào)問題難以解決。深入了解GSTs基因功能和調(diào)控機制，將有助于抗逆轉(zhuǎn)基因育種研究。

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