柳氮磺胺吡啶中一個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)測(cè)定

姚旭波 沈莉 許愛紅

（上海中西三維藥業(yè)有限公司 上海 200331）

柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine，1）作為一個(gè)使用歷史悠久的傳統(tǒng)藥，有抗炎和抗菌的雙重作用，口服后很少吸收，在腸壁中分解起治療作用，多用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療[1-2]。近年的許多資料表明，它還能抑制免疫復(fù)合物及類風(fēng)濕因子的合成，從而對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫病理?yè)p傷發(fā)生影響[3-5]。該藥用于治療炎性腸病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎已有40多年的歷史。20世紀(jì)70年代后期的試驗(yàn)證明，該藥可改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀并能使C反應(yīng)蛋白和血沉有不同程度下降[6-7]。

柳氮磺胺吡啶是由磺胺吡啶和水楊酸經(jīng)重氮偶合反應(yīng)而合成的（圖1）。

圖1 1的合成路線

基于自由基機(jī)理的重氮偶合反應(yīng)復(fù)雜、副產(chǎn)物多，因此柳氮磺胺吡啶成品所含雜質(zhì)比較多，且通過后期的精制方法很難去除。我們?cè)趯?duì)本公司生產(chǎn)的柳氮磺胺吡啶原料藥雜質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)未知雜質(zhì)的含量在0.06%～0.08%之間。根據(jù)人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）技術(shù)指導(dǎo)原則的要求，對(duì)于柳氮磺胺吡啶這個(gè)日服用量超過6 g、未知雜質(zhì)超過0.05%的藥品必須確認(rèn)結(jié)構(gòu)。所以，我們分離提純了這個(gè)雜質(zhì)（2），并確定其結(jié)構(gòu)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AV500型核磁共振儀和micrOTOF II質(zhì)譜儀（瑞士Bruker公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 試劑

1（上海中西三維藥業(yè)有限公司，批號(hào)201204045，純度97.7%）；薄層色譜硅膠H（青島海洋化工廠出品）；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，水為超純水。

2 有關(guān)物質(zhì)的分離與制備

2.1 色譜條件

按照歐洲藥典EP7.7標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)物質(zhì)分析方法分析。色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠（5 μm）為固定相的不銹鋼柱，柱長(zhǎng)25 cm×4.6 mm。檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，流速1.0 ml/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μl。流動(dòng)相A：pH 4.8的磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉1.13 g和醋酸鈉2.5 g，加水900 ml，用冰醋酸調(diào)pH至4.8，并用水稀釋至1 000 ml）；流動(dòng)相B：流動(dòng)相A-甲醇(10：40，v/v)的混合液。洗脫條件見表1。

表1 柳氮磺胺吡啶有關(guān)物質(zhì)液相色譜流動(dòng)相洗脫條件

2.2 方法與結(jié)果

取1適量，用稀氨溶液（氨水7.8 ml，加水稀釋至1 000 ml）配制濃度為1 mg/ml的供試品溶液，進(jìn)樣量20 μl，記錄色譜圖。在上述色譜條件下，1主峰保留時(shí)間為23.070 min，雜質(zhì)2的保留時(shí)間為15.862 min（圖2）。

2.3 2的分離制備

取我公司柳氮磺胺吡啶的精制母液，溶劑經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至褐色黏稠液。取5 g溶于100 ml氯仿-丙酮-甲酸（60：20：2）的混合液中，再加入10 g薄層色譜硅膠H粉，混勻，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸除混合溶劑，得吸附了樣品的混合硅膠H濕粉。將此濕粉放入鼓風(fēng)烘箱內(nèi)烘干，得吸附了樣品的棕黃色混合硅膠H干粉，重約13 g。將此混合硅膠H干粉加入已裝有薄層色譜硅膠H的色譜柱（5 cm×60 cm）中，用氯仿-丙酮-甲酸（60：20：2）洗脫（必要時(shí)可增加甲酸的比例），并用硅膠薄層色譜（以氯仿-丙酮-甲酸=60：30：5為展開劑，在紫外光254 nm下檢視）跟蹤檢測(cè)洗脫液，收集Rf值約為0.45的洗脫液，將其中的溶劑蒸發(fā)除盡，得棕色油狀物2的粗品。該粗品中尚混有殘余的柳氮磺胺吡啶（Rf值約為0.7），需按上述方法經(jīng)過反復(fù)幾次柱層析，才能去除柳氮磺胺吡啶。最后得到淺黃色粉末狀固體2，HPLC含量為99.3%。

圖2 柳氮磺胺吡啶的有關(guān)物質(zhì)色譜圖

3 雜質(zhì)2的結(jié)構(gòu)解析

2在ESI質(zhì)譜條件下的質(zhì)譜主峰為m/z 482.096 2[M+H]+，與推測(cè)的分子式為C22H19N5O4S2的分子量481.087 8相符，可以確定2的分子式為C22H19N5O4S2。

從核磁共振氫譜和碳譜可以看出該結(jié)構(gòu)是完全對(duì)稱的結(jié)構(gòu)（表2），存在兩個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)和兩個(gè)類似于吡啶環(huán)的結(jié)構(gòu)。

表2 2的1H NMR、13C NMR和2D相關(guān)譜數(shù)據(jù)

在1H-1H COSY實(shí)驗(yàn)中，δH7.74和δH7.18相關(guān)，這8個(gè)氫可以確定為兩個(gè)對(duì)位取代苯環(huán)上的氫；δH8.03與δH6.85相關(guān)，δH6.85同時(shí)又與δH7.66相關(guān)，δH7.66同時(shí)和δH7.09相關(guān)，根據(jù)化學(xué)位移和耦合常數(shù)規(guī)律，可以確定δH8.03為芳香環(huán)上N鄰位的氫，即為H-6,6’，δH6.85 歸屬為 H-5,5’，δH7.66 歸屬為 H-4,4’，δH7.09 歸屬為 H-3,3’。

HSQC實(shí)驗(yàn)中，δH9.16和δH11.60的氫沒有對(duì)應(yīng)的相關(guān)碳的信號(hào)，可以確定為活潑氫的信號(hào)。δH9.16歸屬為H-14, δH11.60歸屬為H-13,13’，譜圖中δH11.60的峰積分值偏小，是因?yàn)檫@個(gè)峰比較寬導(dǎo)致積分值不準(zhǔn)確。

NOESY實(shí)驗(yàn)中δH9.16和δH7.18相關(guān)，可以確定δH7.18 為 H-9,9’,11,11’的信號(hào) , 而 δH7.74 就可以確定為H-8,8’,12,12’的信號(hào)。

HSQC實(shí)驗(yàn)中，δH7.74與δC128.47相關(guān)，δC128.47歸屬為 C-8,8’,12,12’； δH7.18 與 δC116.27 相關(guān)，δC116.27 歸屬為 C-9,9’,11,11’； δH8.03 與 δC144.74 相關(guān)，δC144.74 歸屬為 C-6,6’； δH6.85 與 δC115.88 相關(guān)，δC115.88歸屬為C-5,5’；δH7.66與δC139.36相關(guān)，δC139.36歸屬為 C-4,4’；δH7.09與 δC113.06相關(guān)，δC113.06 歸屬為 C-3,3’。

HMBC 實(shí)驗(yàn)中，δH7.66和 δH8.03與 δC153.14相關(guān)，δC153.14歸屬為 C-2,2’；δH7.74與δC145.33相關(guān)，δC145.33歸屬為 C-10,10’；δH7.18與 δC132.75相關(guān)，δC132.75 歸屬為 C-7,7’。

綜合以上信息，將2的結(jié)構(gòu)解析為雙{4-[(2-亞氨基吡啶-1(2H)-基)磺酰]苯基}胺（圖3）。

致謝

本文中的質(zhì)譜委托復(fù)旦大學(xué)檢測(cè)，核磁共振譜委托上海醫(yī)藥集團(tuán)中央研究院檢測(cè)，結(jié)構(gòu)解析得到了上海睿智化學(xué)研究公司的幫助，特此鳴謝。

圖3 2的化學(xué)結(jié)構(gòu)

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