張 蕾，常 宏，徐 東

（1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學基礎課教學部生物化學教研室，河北石家莊050091）

·論 著·

利用雙雜交系統(tǒng)篩選并鑒定與GPR30相互作用的蛋白

張 蕾1，常 宏2*，徐 東1

（1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學基礎課教學部生物化學教研室，河北石家莊050091）

目的篩選并鑒定與GPR30相互作用的蛋白，為GPR30蛋白亞細胞定位和功能研究提供線索。方法應用酵母雙雜交技術，構建誘餌表達載體Pgbk/GPR30，與人卵巢互補DNA（complementary DNA，cDNA）文庫共轉化酵母菌AH109，篩選陽性克隆并測序。利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)驗證GPR30與候選蛋白的相互作用。結果從人卵巢cDNA文庫中篩選出4個與GPR30結合的蛋白基因，分別是小G蛋白Rab8a、Rab40a、NM23-H2和TACC3。其中，小G蛋白Rab8a、Rab40a與GPR30的相互作用在哺乳動物雙雜交系統(tǒng)中得到驗證。結論小G蛋白Rab8a和Rab40a可能參與了GPR30細胞內(nèi)轉運或與GPR30參與的信號轉導有關。

受體，雌激素；雙雜交系統(tǒng)技術；卵巢

雌激素是一種重要的內(nèi)分泌激素，尤其對維持女性多種器官的生理功能具有不可替代的作用，并與乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。在細胞分子水平上，雌激素的作用是通過細胞內(nèi)雌激素受體（estrogen receptor，ERα）介導的。ERα與ERβ作為轉錄調節(jié)因子的功能已被廣泛研究。但20世紀90年代，一種新型的ER即G蛋白耦聯(lián)受體30（G protein-coupled receptor 30，GPR30）被數(shù)個研究團隊相繼分離出來。GPR30在不表達ER與ER的靶器官中參與對雌激素的生理反應，并且與乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關［1－4］。但是，目前對GPR30的功能尚不十分明確，尤其是亞細胞功能定位與參與的信號轉導途徑仍有很大爭議［5－7］。為此，本研究結合酵母雙雜交與哺乳動物雙雜交系統(tǒng)，從人卵巢cDNA文庫中篩選與GPR30相互作用的蛋白，旨在為進一步研究GPR30功能提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料：大腸桿菌JM109為河北醫(yī)科大學基礎課教學部生物化學教研室保存。酵母菌株AH109，營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基，pGBK質粒與matchmaker人卵巢cDNA蛋白表達文庫為Clontech公司產(chǎn)品。CheckMate Mammalian Two-Hybrid System與Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司。DNA重組所用限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，PCR相關試劑，膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒均購自TAKARA公司。細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清，轉染試劑lipofectamine2000購自Invitrogen。HEK293細胞株為贈送。引物合成及測序由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 誘餌質粒的構建與鑒定：PCR擴增GPR30全長，上下游引物5′端分別引入EcoRI與BamHI位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收與pGBKT7載體同時用EcoRI與BamHI雙酶切。酶切產(chǎn)物回收后以T4DNA連接酶連接。重組質粒pGBK-GPR30以測序鑒定。

1.2.2 誘餌蛋白毒性和自激活檢測：將空質粒pGBKT7與重組質粒pGBKT7-GPR30分別轉化酵母AH109細胞，SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)72h。挑取單克隆菌落至液體SD/-Trp培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)24h，比較兩者光密度600（optical density 600，OD600）值，明確GPR30蛋白對酵母菌株AH109有無毒性。將pGBKT7-GPR30質粒轉化AH109細胞，再將轉化的細胞分別鋪在不同的缺陷培養(yǎng)板SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp上，30℃96h觀察酵母生長情況。

1.2.3 人卵巢cDNA文庫篩選：將等量的pGBKT7-GPR30質粒與文庫質粒共同轉化AH109細胞，轉化產(chǎn)物鋪在50個直徑150mm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)至克隆出現(xiàn)（6～9d）。

1.2.4 陽性文庫質粒的分離：利用酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，氯化鈣法轉化JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪LB/Amp板，提取陽性菌落質粒。

1.2.5 陽性質粒的酶切分類和再驗證；將篩選出的陽性質粒，用內(nèi)切酶HindⅢ酶切并進行電泳，將相對分子質量一致的質粒歸為一組。每組選取1個質粒與pGBKT7-GPR30質粒以一對一方式再次轉化AH109細胞，在SD/-Ade/-His/-Trp缺陷培養(yǎng)板上驗證。驗證陽性者送測序。測序結果利用美國國家生物技術信息數(shù)據(jù)庫進行同源性比對。

1.2.6 利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)驗證：GPR30與候選蛋白的相互作用PCR擴增GPR30全長，上下游引物5′端分別引入BamHI與KpnI位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收與pBIND載體同時用BamHI與KpnI雙酶切。酶切產(chǎn)物回收后以T4DNA連接酶連接。以同樣方法將候選基因插入pACT質粒中。將GPR30-pBIND與候選基因-pACT質粒共轉染HEK293細胞，按照Dual-luciferase reporter assay system說明書進行操作，檢測熒光素酶報告基因活性。

2 結 果

2.1 重組質粒的構建與鑒定：重組質粒經(jīng)EcoRI與BamHI酶切，有約1120bp片段插入（圖1）。測序表明插入片段與GPR30開放閱讀框序列完全相符，無堿基突變和缺失，插入方向正確，未發(fā)生讀碼框架改變。

2.2 誘餌蛋白的毒性和自激活檢測：pGBKTGPR30與pGBKT7轉化的AH109酵母細胞培養(yǎng)24h后，OD600分別為1.033與1.041，表明誘餌蛋白對AH108細胞無明顯毒性。

對照pGBKT7-GPR30轉化的AH109酵母細胞在SD/-Trp培養(yǎng)板上的生長情況，在SD/-His/-Trp和SD/-Ade/-Trp培養(yǎng)板上無克隆生長，證明pGBKT-GPR30質粒對報告基因無自激活作用（圖2）。

2.3 文庫篩選及陽性克隆鑒定：pGBKT-GPR30與人卵巢cDNA文庫共轉化AH109酵母細胞后，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培養(yǎng)基上獲得46個克隆。全部克隆經(jīng)酵母質粒提取后，再在大腸桿菌JM109中擴增。將46個質粒以HindⅢ酶切并進行電泳。相同大小的酶切片段視為同一插入片段。這樣，共得到8組陽性克隆質粒。將這8個質粒與pGBKT-GPR30一對一轉化AH109細胞進一步排除假陽性，最終得到6個陽性克?。▓D3）。測序及比對結果表明，有2個為線粒體蛋白，是常見的假陽性序列。其余4個克隆，分別編碼Rab8a、Rab40a、GGA3和TACC3蛋白，做進一步鑒定（圖4）。

2.4 陽性克隆的哺乳動物雙雜交鑒定：將Rab8a、Rab40a、GGA3和TACC3編碼序列插入pACT載體，與GPR30-pBIND載體共轉染HEK293細胞，檢測細胞中螢火蟲熒光素酶含量表明，Rab8a和Rab40a攜帶的報告基因成功激活螢火蟲熒光素酶表達（圖5）。

3 討 論

GPR30可與雌激素特異性結合并介導環(huán)磷酸腺苷活化，但其作用模式和效應與ER不同，且與ER沒有同源性［8］。同時，GPR30具有經(jīng)典的7次跨膜結構，屬G蛋白耦聯(lián)受體家族。因此，可視為一種新型的雌激素膜性受體。但是，還未揭示GPR30是如何參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，甚至其亞細胞定位仍存在很大爭議。有報道［5］指出，在共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白標記的GPR30主要集中在COS-7細胞的內(nèi)質網(wǎng)中。但亦有報道［9］指出HEK293細胞中GPR30表達在細胞膜上。本實驗利用酵母和哺乳動物雙雜交系統(tǒng)成功地篩選到2個可能的GPR30相互作用蛋白，Rab8a和Rab40a，為進一步研究GPR30的亞細胞定位和參與的信號途徑提供了線索。Rab蛋白是小分子三磷酸鳥苷結合蛋白家族中最大的亞家族。在人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過60余種Rab蛋白，它們廣泛參與細胞內(nèi)囊泡的運輸，調節(jié)生物體內(nèi)各種蛋白在細胞內(nèi)外的正確運輸和分配［10］。其中Rab8更是被報道參與GPCR從內(nèi)質網(wǎng)到細胞膜的定向運輸［11］。而Rab40，至今并沒有深入的細胞功能研究。我們推測，或許Rab8和Rab40在不同細胞和組織的表達差異，造成了GPR30在不同的細胞模型中有不同的亞細胞定位。本實驗利用酵母雙雜交與哺乳動物雙雜交系統(tǒng)相結合的方法，對尋找結構復雜蛋白的相互作用蛋白進行了探索。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，由于蛋白質表達在酵母細胞中，往往不能象在哺乳動物細胞中進行正確的三維折疊和翻譯后修飾，從而易造成假陽性。因此，酵母雙雜交的結果通常要進行免疫共沉淀等實驗進一步確認。而GPR30屬7次跨膜結構蛋白，存在大量的疏水區(qū)，在相對溫和的細胞裂解液中不易溶解。在含有較強變性劑的細胞裂解液中，蛋白質與蛋白質的相互作用又容易被破壞。因此，利用免疫共沉淀驗證多次跨膜受體的相互作用蛋白易造成假陰性。因此，在設計本實驗時，我們利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)做進一步驗證。哺乳動物雙雜交系統(tǒng)具有與酵母雙雜交系統(tǒng)相同的作用原理，但是蛋白在哺乳動物細胞中表達，其構象和修飾接近生理狀態(tài)，容易排除假陽性［12］。本實驗中，NM23-H2和TACC3由于無法在哺乳動物雙雜交系統(tǒng)中得到證明而被排除。

綜上所述，本實驗成功鑒定出與GPR30相互作用的2個蛋白——同屬小G蛋白家族的Rab8和Rab40，為進一步研究GPR30在細胞內(nèi)的轉運提供了線索。（本文圖見封二）estrogen receptor，GPR30，with breast tumor metastasis and transactivation of the epidermal growth factor receptor［J］.Steroids，2008，73（9/10）：870－873.

［2］FILARDO EJ，GRAEBER CT，QUINN JA，et al.Distribution of GPR30，a sevenmembrane-spanning estrogen receptor，in primary breast cancer and its association with clinicopathologic determinants oftumor progression［J］.Clin Cancer Res，2006，12（21）：6359－6366.

［3］VIVACQUA A，BONOFIGLIO D，RECCHIA AG，et al.The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the proliferative effects induced by 17 beta-estradiol and hydroxytamoxifen in endometrial cancer cells［J］.Mol Endocrinol，2006，20（3）：631－646.

［4］ALBANITO L，MADEO A，LAPPANOR，et al.G protein-coupled receptor 30（GPR30）mediates gene expression changes and growth response to 17 beta-estradiol and selective GPR30 ligand G-1 in ovarian cancer cells［J］.Cancer Res，2007，67（4）：1859－1866.

［5］REVANKAR CM，CIMINO DF，SKLAR LA，et al.A transmembrane intra-cellular estrogen receptormediates rapid cell signaling［J］.Science，2005，307（5715）：1625－1630.

［6］FILARDO E，QUINN J，PANG Y，et al.Activation of the novel estrogen receptor G protein-coupled receptor 30（GPR30）at the plasma membrane［J］.Endocrinology，2007，148（7）：3236－3245.

［7］OTTO C，ROHDE-SCHULZ B，SCHWARZ G，et al.G proteincoupled receptor 30 localizes to the endoplasmic reticulum and is not activated by estradiol［J］.Endocrinology，2008，149（10）：4846－4856.

［8］FILARDO EJ，QUINN JA，F(xiàn)RACKELTON AR JR，et al.Estrogen action via the G protein-coupled receptor，GPR30：stimulation of adenylyl cyclase and cAMP-mediated attenuation of the epidermal growth factor receptor-to-MAPK signaling axis［J］.Mol Endocrinol，2002，16（1）：70－84.

［9］FILARDO E，QUINN J，PANG Y，et al.Activation of the novel estrogen receptor G protein-coupled receptor 30（GPR30）at the plasma membrane［J］.Endocrinology，2007，148（7）：3236－3245.

［10］PEREIRA-LEAL JB，SEABRA MC.Evolution of the rab family of small GTP-binding proteins［J］.Mol Biol，2001，313（4）：889－901.

［11］DONG C，YANG L，ZHANG X，et al.Rab8 interactswith distinct motifs inα2B-andβ2-adrenergic receptors and differentially modulates their transport［J］.Biol Chem，2010，285（26）：20369－20380.

［12］LIEVENSS，LEMMENS I，TAVERNIER J.Tavernier mammalian two-hybrids come of age［J］.Trends Biochem Sci，2009，34（11）：579－588.

（本文編輯：趙麗潔）

［1］FILARDO EJ，QUINN JA，SABO E.Association of themembrane

SCREENING OF GPR30 INTERACTING PROTEINS BY TWO-HYBRID SYSTEM

ZHANG Lei1，CHANG Hong2*，XU Dong1
（1.Department of Cardiology，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China；2.Department of Biochemistry，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China）

receptors，estrogen；two-hybrid system techniques；ovary

R349.81

A

1007-3205（2013）04-0378-03

2013－02－25；

2013－04－02

張蕾（1974－），女，湖北武漢人，首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事影像學及細胞生物學診斷研究。

*通訊作者。E-mail：ch720321＠126l.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.003

【關鍵詞】ABSTRACT：ObjectiveTo screen and identify the GPR30 interacting proteins and provide clues for GPR30 protein subcellular localization and cellular function.M ethodsThe bait expression vector pGBK/GPR30 was constructed and co-transformed with human ovarian cDNA library into yeast AH109 cells for yeast two-hybrid screening.Candidate interacting proteins were confirmed by mammalian twohybrid system.ResultsThe genes coding for four proteins that can bind to GPR30 were selected from human ovarian cDNA library，small G proteins Rab8a，Rab40a，NM23-H2 and TACC3.And the interaction between GPR30 and small G proteins Rab8a，Rab40awas confirmed bymammalian two-hybrid system.Conclusion Small G proteins Rab8a and Rab40amay be involved in the intracellular transport of GPR30 or GPR30 mediated signal transduction by direct interaction.