系統(tǒng)生物學(xué)在中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用

茍小軍 夏云 曲虹 楊曉露

證候研究是中醫(yī)基礎(chǔ)研究的一個(gè)關(guān)鍵的科學(xué)問題，中醫(yī)的“證”是辨證論治的起點(diǎn)和核心。中醫(yī)證候是疾病發(fā)生和演變過程中特定階段以及患者個(gè)體當(dāng)時(shí)所處特定內(nèi)外環(huán)境的本質(zhì)的反映，是機(jī)體對體內(nèi)外各種環(huán)境變化和致病因素做出反應(yīng)的一種功能狀態(tài)。由于中醫(yī)的證候是通過望、聞、問、切四診所獲得的外候即表現(xiàn)為一組有相互關(guān)聯(lián)的癥狀和體征群的信息歸納整理而得，缺乏客觀化指標(biāo)，人們期望通過現(xiàn)代科學(xué)方法，力圖解讀證候的內(nèi)涵。而系統(tǒng)生物學(xué)是以系統(tǒng)理論為指導(dǎo)，來研究一個(gè)生物系統(tǒng)中所有組成成分(基因、mRNA、蛋白質(zhì)等)的構(gòu)成，以及在特定條件下這些組分間相互關(guān)系的科學(xué)[1]。系統(tǒng)生物學(xué)研究的最終目的是解析生命過程的復(fù)雜性，利用整體性、系統(tǒng)性研究手段來發(fā)現(xiàn)和揭示生命活動的本質(zhì)規(guī)律[2]。系統(tǒng)生物學(xué)體現(xiàn)了整合的思想，它的基本理念與傳統(tǒng)中醫(yī)強(qiáng)調(diào)人與社會環(huán)境的整體觀、辨證施治等思想十分吻合，使中醫(yī)學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)更容易找到共同語言[3]。因此，中醫(yī)證候研究引入系統(tǒng)生物學(xué)可以更好地闡明證候?qū)嵸|(zhì)，使證候得到客觀、定量的描述，從而促進(jìn)中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)的研究。系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)平臺包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，下面就主要從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)四個(gè)方面來談?wù)勏到y(tǒng)生物學(xué)在中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用。

1 基因組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候研究中的運(yùn)用

基因組學(xué)(Genomics)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一門科學(xué)，它主要是對生物體內(nèi)所有基因進(jìn)行繪圖、核苷酸序列分析以及基因定位和基因功能分析[4]，從整體上對基因的活動規(guī)律進(jìn)行探討，研究內(nèi)容涉及基因組的表達(dá)、基因的多樣性、基因組功能的闡釋及蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能等，它從整個(gè)基因組的層面來闡釋所有基因在染色體上的位置、結(jié)構(gòu)、基因產(chǎn)物的功能及基因之間的關(guān)系[5]。基因組學(xué)研究的方法學(xué)內(nèi)容與中醫(yī)學(xué)的整體觀、辨證觀有很多相似之處，通過基因組學(xué)研究，建立不同證候類型的基因變異及基因表達(dá)差異譜和功能基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并從基因組學(xué)的角度進(jìn)一步探討證候的實(shí)質(zhì)[6]。目前，已有不少學(xué)者在基因水平上對證的實(shí)質(zhì)研究作了有益探索。翁莉等[7]選取肝腎陰虛證與非肝腎陰虛證肝癌患者作為研究對象,以肝腎陰虛證肝癌患者為試驗(yàn)組,以非肝腎陰虛證肝癌患者作為對照組，選用全基因組表達(dá)譜芯片,研究肝腎陰虛證的基因表達(dá)譜,并進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,結(jié)果表明肝腎陰虛證組和非肝腎陰虛證組間存在差異基因表達(dá)特征圖譜，該研究從基因組學(xué)的角度進(jìn)一步證實(shí)了“證”是多基因在mRNA和(或)蛋白質(zhì)水平發(fā)生改變并導(dǎo)致人體偏離正常狀態(tài)的假說。楊嬋娟等[8]對正常健康者及肝郁脾虛證、脾胃濕熱證患者血液進(jìn)行基因芯片檢測，利用隨機(jī)方差模型篩選差異基因。該研究結(jié)果表明兩證型間獲得125個(gè)差異基因(其中66個(gè)為上調(diào)基因，59個(gè)為下調(diào)基因)，這些差異基因的主要功能為跨膜運(yùn)輸、硒反應(yīng)離子、鈣離子依賴的胞吐作用等。該研究提示中醫(yī)證候分類學(xué)具有基因表達(dá)譜依據(jù)，基因組學(xué)研究方法有望為中醫(yī)辨證提供客觀依據(jù)。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候研究中的運(yùn)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)是一門在整體水平上研究某一時(shí)刻某一類細(xì)胞中全部轉(zhuǎn)錄本種類、結(jié)構(gòu)和功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。轉(zhuǎn)錄組也稱為表達(dá)譜，表達(dá)譜可以提供一定條件下一些基因表達(dá)的信息，并據(jù)此推斷相應(yīng)未知基因的功能，揭示特定調(diào)節(jié)基因的作用機(jī)制[9]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在mRNA水平研究基因表達(dá)譜，用DNA芯片測定mRNA的豐度，提供了一個(gè)可在基因組水平上進(jìn)行高通量、平行檢測的工具。由于基因芯片的高通量和簡便易行的特點(diǎn),該方法在中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中最為常用,實(shí)現(xiàn)揭示疾病證候?qū)嵸|(zhì)的目標(biāo)。王琦等[10]挑選3例非痰濕型體質(zhì)肥胖人、2例痰濕型體質(zhì)肥胖人和3例正常體重者,進(jìn)行外周血基因表達(dá)譜研究。結(jié)果痰濕型體質(zhì)與非痰濕型體質(zhì)相比,有115個(gè)差異表達(dá)探針組，該研究發(fā)現(xiàn)痰濕型體質(zhì)人的外周血相關(guān)基因表達(dá)與非痰濕型體質(zhì)人有明顯差異。劉清華等[11]選取原發(fā)性肺癌脾虛痰濕型的患者，分別取患者腫瘤組織及正常肺組織，構(gòu)建正反向消減cDNA文庫,進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)陽性克隆，經(jīng)測序確定了那些有明確生物學(xué)功能的證候相關(guān)基因，其基因表達(dá)及分布特征初步反映了肺癌脾虛痰濕型在分子層面的證候特點(diǎn)，對闡釋中醫(yī)肺癌典型證候的實(shí)質(zhì)有重要意義。嚴(yán)石林等[12]研究慢性腎炎、糖尿病腎病、陽痿病中篩選出的典型腎陽虛證的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，分別對9種不同疾病的腎陽虛證，進(jìn)行表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)，對差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway分析，找出3種不同疾病腎陽虛證的共同差異表達(dá)基因332條。3種不同疾病腎陽虛證共同的信號通路有37個(gè)，并從3組疾病各自特有的差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)3條信號通路與腎陽虛證共有的信號通路一致。這3條信號通路差異調(diào)控，可能決定了腎陽虛證“同證異治”的轉(zhuǎn)錄組學(xué)基礎(chǔ)。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候研究中的運(yùn)用

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是指基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或細(xì)胞、組織、機(jī)體在特定時(shí)間和空間所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，它不同于傳統(tǒng)的對一個(gè)或某一類蛋白質(zhì)研究，而是從整體角度分析蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞生命活動的規(guī)律[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究對象是組織或者細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)，從不同層次“整體”的蛋白質(zhì)活動的角度來揭示和闡明證候形成和發(fā)展規(guī)律。通過探討證候形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，最終在整體蛋白質(zhì)表達(dá)水平上闡明證候的本質(zhì)[13]。袁宏偉等[14]選取心氣虛弱、心腎陰虛證型進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，探索冠心病不同證型的蛋白質(zhì)表達(dá)差異并分析其相關(guān)性。該研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)差異蛋白，這些差異蛋白與不同證候的形成有關(guān)，有望作為證候?qū)嵸|(zhì)的標(biāo)志性蛋白。Ya-nan Song等[15]曾選取健康志愿者(24例)、慢性乙型肝炎實(shí)證患者(25例)以及慢性乙型肝炎虛證患者(19例)的血液進(jìn)行了蛋白質(zhì)分析測試。對健康組、慢性乙型病毒性肝炎實(shí)證、慢性乙型肝炎虛證各組所對應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS分析，發(fā)現(xiàn)三組樣本在空間分布上有明顯的區(qū)分。另外，進(jìn)行了差異蛋白的分析，篩選出實(shí)證和虛證組間有明顯變化的2個(gè)蛋白點(diǎn)，并證實(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)可用于中醫(yī)證候的分類研究。王立等[16]選擇腦梗死肝陽化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動證患者，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度比較腦梗死肝陽化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動證，建立了腦梗死肝陽化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動證血清雙向凝膠電泳圖譜，并鑒定了部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。該研究從更深層次闡明腦梗死肝陽化風(fēng)證與陰虛風(fēng)動證的病理生理機(jī)制，并認(rèn)為蛋白質(zhì)組學(xué)能在腦梗死不同證型具有代表意義。

4 代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候研究中的運(yùn)用

代謝組學(xué)(Metabolomics)是系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律并揭示機(jī)體生命活動代謝本質(zhì)的科學(xué)，是系統(tǒng)生物學(xué)研究不可或缺的重要學(xué)科之一。通過觀察生物樣品中所有可測代謝物的綜合表現(xiàn)，探討內(nèi)因或外因引起的生物體內(nèi)的生理、生化變化及其生物學(xué)意義[17]。從系統(tǒng)生物學(xué)的觀點(diǎn)而言，中醫(yī)“證候”可能是人體基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)被“擾動”后導(dǎo)致的一種特異的生理病理狀態(tài)，并通過其分泌到血液、尿液的內(nèi)源性成分的改變以組、群、譜的特征而客觀地反映出來，而代謝組學(xué)正是具備解決這些組、群、譜集成問題的功能[18]。代謝組學(xué)研究具有整體性、動態(tài)性、綜合性的特點(diǎn)，能夠從代謝網(wǎng)絡(luò)的角度整體反映生物體的功能水平，與傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的整體觀、系統(tǒng)觀十分相似[19]。代謝組學(xué)研究從整體出發(fā)，認(rèn)識和把握細(xì)節(jié)，捕捉到代謝網(wǎng)絡(luò)的細(xì)微變化獲得偏離出正常范圍的特征性代謝表達(dá)圖譜，進(jìn)而提取有意義的功能信息，進(jìn)行歸納和整合。這些代謝圖譜可能是中醫(yī)證候規(guī)律的物質(zhì)基礎(chǔ)在代謝物水平上的反映。劉志剛等[20]選擇40例慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期肺氣虛證患者(肺氣虛證組)，給予六味補(bǔ)氣膠囊進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)健康對照組(37名)。采用高效液相色譜—二極質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測血漿代謝物，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，肺氣虛證組治療前的代謝譜與健康對照組明顯不同，治療后有向健康對照組回歸的趨勢，找到了15種肺氣虛證可能的疾病標(biāo)記物。尤麗等[21]對33例腎虛痰瘀型2型糖尿病患者和50例健康人血清進(jìn)行核磁共振氫譜檢測,運(yùn)用正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)分析所采集的圖譜。結(jié)果顯示,腎虛痰瘀型2型糖尿病患者與健康人相比血清中多種氨基酸顯著降低，同時(shí),腎虛痰瘀型2型糖尿病患者血清中α-葡萄糖及β-葡萄糖較健康人增加,腎虛痰瘀型2型糖尿病患者代謝成分與健康人存在顯著差異,腎虛痰瘀型2型糖尿病患者體內(nèi)的三羧酸循環(huán)及糖酵解途徑被抑制,蛋白質(zhì)代謝異常,支鏈氨基酸代謝增強(qiáng)。王娟等[22]利用磁共振波譜代謝學(xué)方法研究冠心病不穩(wěn)定心絞痛血瘀證患者尿液代謝物的變化，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)冠心病不穩(wěn)定心絞痛血瘀證患者尿液中多個(gè)物質(zhì)的含量發(fā)生了變化，該研究表明尿液樣品中檸檬酸、脯氨酸、異亮氨酸、?；撬岬却x物的改變構(gòu)成了冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者的代謝組學(xué)特征，從而為疾病的診斷和治療以及中醫(yī)證候研究提供了新思路和新方法。這些研究進(jìn)一步證實(shí)了基于代謝組學(xué)的方法研究中醫(yī)證的可行性。代謝組學(xué)技術(shù)可以成為揭示中醫(yī)證候本質(zhì)研究的強(qiáng)有力的工具。

5 結(jié)論

總之，中醫(yī)學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)有許多共同特征，系統(tǒng)生物學(xué)理論與技術(shù)在中醫(yī)證候研究中已被廣泛運(yùn)用，眾多學(xué)者構(gòu)建了“證候基因組譜”、“證候蛋白質(zhì)組譜”、“證候轉(zhuǎn)錄組譜”、“證候代謝組譜”，為中醫(yī)證候的量化、客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化以及證候本質(zhì)的研究找到了新的技術(shù)平臺，所以從系統(tǒng)生物學(xué)角度出發(fā)，研究中醫(yī)證候不僅成為可能，也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)的思路和方法研究中醫(yī)證候,雖然已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,尚未取得根本性的突破，也存在一定的問題。絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究手段均采用單一的組學(xué)技術(shù),只是一種平行性研究,各組學(xué)在研究目的、內(nèi)容及手段上有所不同，同時(shí)各組學(xué)也存在一定的缺陷，難以深度反映系統(tǒng)生物學(xué)在思路和技術(shù)上的整合性。為此，筆者希望中醫(yī)證候研究應(yīng)在系統(tǒng)生物學(xué)的理論和方法的引領(lǐng)下，綜合數(shù)學(xué)、信息科學(xué)和生物學(xué)等多學(xué)科知識，在基因組、mRNA組、蛋白質(zhì)組和代謝組等各個(gè)層面開展組學(xué)研究，通過數(shù)據(jù)的整合，來建立證候的診斷模型，精確、量化地預(yù)測證候，期待中醫(yī)證候研究能有更大的新的突破。

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