侯 元， 霍德勝， 劉永茂

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗教學(xué)中心，吉林長春130021)

0 引言

實驗教學(xué)是高等學(xué)校教學(xué)過程中的一個重要環(huán)節(jié)，是高等學(xué)校的生命線，也是培養(yǎng)學(xué)生實際操作能力的重要環(huán)節(jié)［1］。實驗教學(xué)方法有多種，如:基礎(chǔ)性實驗和驗證性實驗，設(shè)計性實驗，綜合性實驗和創(chuàng)新性實驗?；A(chǔ)性實驗和驗證性實驗主要側(cè)重于對理論知識的理解和記憶，創(chuàng)新性實驗是與驗證性實驗相對應(yīng)的，具有探索性和創(chuàng)造性的實驗，其出發(fā)點是充分發(fā)揮學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性、主動性和創(chuàng)造性，激發(fā)學(xué)生對科學(xué)技術(shù)的興趣，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神和實踐能力［2］。為此，我們結(jié)合臨床將科研成果轉(zhuǎn)化為實驗教學(xué)項目，開展了創(chuàng)新型實驗設(shè)計。

1 實驗設(shè)計的目的方法和意義

目前，男性因素在不孕不育癥病因中占很大比例，精液分析在診斷男性不育及輔助生殖方面有重要作用。精液分析主要包括精子形態(tài)、密度和活力［3］。

1.1 精子細胞形態(tài)學(xué)檢測

精子形態(tài)是評價男性生育力的一個重要參數(shù)，資料表明正常精子形態(tài)(strict criteria)是體外受精主要預(yù)測參數(shù)，被認為是衡量男性生育力的較好指標［4］。

實驗課上，教師首先提供給學(xué)生一種簡單的檢測方法，即瑞士-吉姆薩染色法:標本用生理鹽水洗滌3次，離心、涂片、晾干，用95%乙醇固定10 min，瑞士-吉姆薩染液染色30～60 s;加等量磷酸鹽染色5～8 min，流水沖洗后，置95%的乙醇中2～4 s，自然干燥后，用樹膠封片，結(jié)果顯示了精子的正常形態(tài)和異常形態(tài)。

通過實驗操作，不但掌握了細胞染色技術(shù)，同時對觀察到的各種細胞形態(tài)產(chǎn)生了極大的興趣，引發(fā)了他們的好奇心，引導(dǎo)他們進一步的思考。比如，這些千奇百怪的異常形態(tài)是由什么因素造成的，有沒有其他更好的檢查方法。同學(xué)們主動查閱各種資料尋找答案，最終發(fā)現(xiàn):目前，精子形態(tài)分類標準不統(tǒng)一，各國執(zhí)行的統(tǒng)一精子形態(tài)評價標準受到質(zhì)疑。并且多數(shù)對精子形態(tài)的分析，是在經(jīng)典光學(xué)顯微鏡的油鏡下觀察，主觀因素較大。一些參數(shù)無法檢測，亦不可能對大量樣本進行分析?，F(xiàn)有報道用計算機輔助精液分析系統(tǒng)(CASA和ASMA)為精子形態(tài)、動態(tài)分析提供了便利，提高了實驗準確性和客觀性［5］。隨后，學(xué)生走出教室，走進臨床醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，采用WLJY-9000型彩色精子形態(tài)檢查系統(tǒng)人工修正方法分析精子形態(tài)。操作過程中精液凃片用改良巴氏染色。形態(tài)按系統(tǒng)設(shè)定程序分為11類，即形態(tài)正常精子、大頭精子、小頭精子、梨形頭精子、錐形頭精子、無定形頭精子、空泡樣頭精子、雙頭精子、頸部和中段缺陷精子、尾部形態(tài)缺陷精子，和其他形態(tài)缺陷精子。為提高閱片準確性，同一份樣本由兩位檢測人員進行精子形態(tài)分析。這一社會實踐活動進一步激發(fā)了學(xué)生們科學(xué)研究的熱情。

1.2 精子活率與活力測定

精子的成活率對于生育也是至關(guān)重要的。精子活率測定方法采用伊紅-Y染色法，即取精子標本用伊紅Y染色，裝片，鏡檢，死精子呈紅色，活精子不著色。計數(shù)200個精子，計算得出活精子百分數(shù)。

此實驗在使學(xué)生掌握了細胞制片技術(shù)和顯微鏡使用方法的同時，進一步了解精子運動特征對生育能力的影響。

Hirano等認為，評估精子運動速度是預(yù)測受精率的有利參數(shù)。本實驗采用國產(chǎn)WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)，進行精子活力分析。測定參數(shù)主要包括，精子曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、直線性(LN)、前向性(STR)、擺動性(WOB)、頭部側(cè)擺幅度(ALH)、鞭打頻率(BCF)、平均移動角度(MAD)。通過這個實驗，引發(fā)學(xué)生深入思考，如精子的活力受哪些因素影響，精子的運動速度與精子形態(tài)有何關(guān)系，造成精子死亡因素有哪些。

帶著一大堆的疑問學(xué)生們走進了圖書館。他們孜孜不倦的查閱文獻資料，真正理解了細胞是生物體結(jié)構(gòu)與功能的基本單位這個定義的內(nèi)涵［6］。構(gòu)成人體或其他高等動物體的細胞種類繁多、形態(tài)各異，這些細胞的形態(tài)與其功能往往相適應(yīng)。善于運動的精子是由于它長了一根長長的鞭毛［7］。Katz等［8］認為精子頭部幾何形態(tài)異常是導(dǎo)致精子運動異常的主要原因。由于研究手段不同，也有不同結(jié)果報道，認為精子頭部畸形引起其流體力學(xué)特性改變導(dǎo)致的運動性改變、尾部受損引起運動方式改變的可能性很小。一些外界因素共同作用于精子形態(tài)和動態(tài)，引起兩者同時改變是導(dǎo)致精子形態(tài)和動態(tài)異常相伴產(chǎn)生的主要原因［5］。

學(xué)生們在教師的指導(dǎo)下繼續(xù)探索，對這些問題有了進一步認識:精子DNA與體細胞結(jié)構(gòu)不同。精子DNA損傷是造成精子畸形和運動速度、方向改變的根源。精子DNA損傷會影響受精、受精卵分裂和胚胎發(fā)育，最后導(dǎo)致不孕不育、流產(chǎn)死胎、胎兒、嬰兒發(fā)育異常。造成精子損傷的因素很多，如藥物、放射線、高溫、生殖道炎癥、環(huán)境毒素、高齡和生活方式［9］。有報道，吸煙者的精子DNA斷裂顯著增高，吸煙對精子核質(zhì)量是有害的。精子DNA損傷發(fā)生率與精子密度、活動力、形態(tài)等參數(shù)有高度的負相關(guān)性。吸煙導(dǎo)致弱精子癥和畸精子癥，輕度吸煙對精子活力有影響，重度吸煙對精子形態(tài)有影響。吸煙男性的精子密度和形態(tài)低于不吸煙者，且吸煙對精子參數(shù)的影響有劑量依賴性［10］。長期大量吸煙對精子凋亡有明顯影響［11］。原因是:香煙煙霧中的誘變物質(zhì)，不僅可以造成體細胞遺傳物質(zhì)的損傷，還可以通過血-生殖腺屏障對生殖細胞或精子的發(fā)育造成影響。導(dǎo)致精子DNA斷裂增加，精子畸形增多［12］。慢性酒精中毒能使正常形態(tài)精子數(shù)下降。原因是:慢性酒精中毒引起維生素A和鋅的缺乏，進而精子上皮細胞發(fā)育不良，導(dǎo)致少精子癥和無精子癥［13］。桑拿浴或經(jīng)常用溫度較高的水淋浴及在桑拿房停留的時間過久，可導(dǎo)致精子生成減少，或出現(xiàn)死精子［14］。因為探討的內(nèi)容與日常生活密切相關(guān)，引發(fā)了學(xué)生的好奇心，調(diào)動了學(xué)習(xí)的積極性。

1.3 白細胞檢測

檢測精液中白細胞是否存在，是尋找不孕不育癥病因手段之一。本實驗聯(lián)苯胺染色法:取精子細胞標本1滴，加入1滴聯(lián)苯胺染液，混勻，于37℃放置20 min，鏡檢，白細胞染成褐色，其他細胞染成品紅色。采用聯(lián)苯胺染色方法，依據(jù)白細胞內(nèi)源性過氧化物酶，而使過氧化物酶陽性白細胞染成棕色。在有過氧化氫存在時MPO分解H2O2，產(chǎn)生新生態(tài)氧，將聯(lián)苯胺氧化成帶酯式結(jié)構(gòu)的有色化合物。此方法涉及了生物化學(xué)中酶和底物特異性結(jié)合的理論知識與無機化學(xué)中的氧化還原反應(yīng)等知識點。

為什么有的樣本中存在白細胞?這對精子的形態(tài)、活力和活率有何影響，其發(fā)生機制如何?學(xué)生們經(jīng)過深入探討得知:因為有炎癥反應(yīng)，才使白細胞增多。精子中增多的白細胞可以刺激人類精子產(chǎn)生活性氧(Reactive Orygen Species，ROS)，這種刺激可以通過細胞-細胞接觸或白細胞產(chǎn)生的可溶性產(chǎn)物等多種途徑介導(dǎo)。25%～40%的不育男性精液中存在高水平的ROS［9］。當(dāng)過量ROS超過了抗氧化系統(tǒng)的清除能力和防御能力時，則導(dǎo)致精子DNA雙鏈斷裂，產(chǎn)生單鏈。且由于精子細胞膜中含有大量不飽和脂肪酸，因此理論上精子極易受到ROS的損害。精子DNA被破壞后，精子的形態(tài)、活力和活率也就發(fā)生了相應(yīng)的變化。

1.4 精子冷凍與復(fù)蘇

精子的細胞學(xué)分析實驗，對標本的活性要求很高。因此掌握精子的凍存與復(fù)蘇技術(shù)是非常必要的。

(1)冷凍。將精液與保護劑1∶1混勻后，裝入布袋，放在液氮液面上20 cm處冷凍20 min，再浸入液氮。

(2)復(fù)蘇。將凍存的標本從液氮中取出后直接放入37℃水浴中5 min即可。

這個實驗讓學(xué)生親眼看到細胞經(jīng)超低溫冷凍后，仍能恢復(fù)原始狀態(tài)。

2 儀器設(shè)備及試劑

(1)儀器。自動平衡離心機、液氮罐、恒溫水浴、恒溫培養(yǎng)箱、WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)。

(2)試劑。伊紅Y、聯(lián)苯胺、甲醇、玫瑰紅、雙氧水、瑞氏染液、吉姆薩染液、乙醇、甘油等。

3 結(jié)果與討論

本實驗設(shè)計由觀察精子的形態(tài)入手，進而分析了精子的活力與活率，以及引起它們發(fā)生改變的各種外界因素。挖掘了男性不育癥的根源。通過對患者精子活力檢查、精子細胞形態(tài)學(xué)檢查、白細胞的檢查;學(xué)生掌握了精子細胞的形態(tài)學(xué)的檢測方法，熟悉了顯微鏡和離心機等簡單設(shè)備的使用方法，了解了自動化儀器的檢測方法。通過精子的冷凍與復(fù)蘇，掌握了細胞保存的原理和方法。

本實驗設(shè)計始終堅持基礎(chǔ)與臨床相結(jié)合的原則，使學(xué)生對探索醫(yī)學(xué)科學(xué)的奧秘產(chǎn)生了濃厚的興趣。增強了學(xué)生學(xué)習(xí)的主動性與自覺性，實驗收到了良好的教學(xué)效果。

4 結(jié)語

精子細胞學(xué)分析這一創(chuàng)新實驗體系，通過五屆臨床醫(yī)學(xué)七年制和六屆臨床醫(yī)學(xué)五年制的教學(xué)實踐證明，其方法具有創(chuàng)新性、針對性、實用性和可行性。由于它來自臨床科研成果的轉(zhuǎn)化，與臨床檢驗關(guān)系密切。因此能極大地調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，引發(fā)學(xué)習(xí)興趣。培養(yǎng)學(xué)生的科研意識和創(chuàng)新思維。提高學(xué)生綜合運用知識，分析問題解決問題的能力［15］。從而使學(xué)生站在科學(xué)領(lǐng)域的前沿來了解科學(xué)發(fā)展的動態(tài)。以便盡快地適應(yīng)社會發(fā)展的需要。

［1］ 吳瑤慶，張福辰，黃勝君.一個創(chuàng)新型實驗項目的設(shè)計［J］.實驗技術(shù)與管理，2008，25(12):30-33.

［2］ 白廣梅，王小逸.創(chuàng)新性實驗教學(xué)的思考［J］.實驗技術(shù)與管理，2008，25(2):128-129.

［3］ 禹 智，劉睿智.精子形態(tài)檢測標準化研究進展［J］.中國婦幼保健，2010，25(19):2755.

［4］ 王洪亮，劉睿智，張紅國，等.精子形態(tài)與精子活率的關(guān)系［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，32(4):678-680.

［5］ 馬玉涵，劉睿智，許宗革，等.精子形態(tài)與精子運動參數(shù)關(guān)系研究［J］.中華男科學(xué)，2006，12(7):590-593.

［6］ 余從年，胡繼鷹.醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)導(dǎo)論［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［7］ 李 凡，劉永茂.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教程［M］.北京:高等教育出版社，2002.

［8］ Katz D F，Diel L，Overstreet JW.Differenccs in the movement of morphologically normal and abno rmal human seminal spermatozoa［J］.Biolreprod，1982，26(4):566-570.

［9］ 戴汝琳，劉睿智.影響精子DNA損傷因素研究進展［J］.生殖與避孕，2009，29(6):385-388.

［10］ 劉俊茹，陳明強，文陶非，等.吸煙對精子DNA完整性、精子參數(shù)的影響［J］.Maternal and Child Health Care of China，2009，24(33):4717-4718.

［11］ 王光榮，周曾娣，葛爭鳴.吸煙對精子凋亡的影響［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2005，5(5):25-26.

［12］ 李義平，王 平，王亞文.香煙主流煙霧與側(cè)流煙霧對小鼠致突變作用的研究［J］.中國公共衛(wèi)生，2001，17(8):707-708.

［13］ 谷振環(huán)，劉睿智，孫 嬌，等.吸煙飲酒與精子形態(tài)的相關(guān)性及雙因素對精子形態(tài)影響［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34(14):2617-2619.

［14］ 郭 航，張紅國，薛百功，等.吸煙、飲酒和桑拿對精子形態(tài)的影響［J］.中華男科學(xué)雜志，2006，12(3):215-217.

［15］ 袁廣卿，周俊宣，駱曉楓，等.開放實驗室探索創(chuàng)新性實驗項目的實踐［C］//第二屆全國醫(yī)學(xué)類實驗教學(xué)研討會(論文匯編)，2009:199.