張 亞， 馮志新， 姚景霆，3， 華利忠， 甘 源， 劉占軍， 韋艷娜， 邵國(guó)青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801)

隨著人們對(duì)黏膜免疫認(rèn)識(shí)程度的加深，黏膜免疫系統(tǒng)的研究不僅為傳統(tǒng)的免疫學(xué)增加新內(nèi)容，也為很多疾病的致病機(jī)理、病原與宿主的關(guān)系、疾病診治及新型疫苗與預(yù)防制劑等的研究提供了思路與方法。黏膜免疫和黏膜一起構(gòu)成了機(jī)體防御外來病原入侵的第一道屏障［1］。黏膜免疫產(chǎn)生的抗體主要以分泌型的IgA(SIgA)為主［2］。研究表明，SIgA抗體在抵御病原體的感染過程中起到了重要的作用［3］。利用感染敲除基因的小鼠模型試驗(yàn)證實(shí)了SIgA在對(duì)許多傳染性病原的保護(hù)和交叉保護(hù)中起到了重要的作用［4］。因此，黏膜表面總IgA或特異性IgA已成為了疾病診斷和一些疫苗免疫效果評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，黏膜分泌物如鼻拭子、陰道拭子、唾液等因?yàn)椴杉?jiǎn)單，對(duì)機(jī)體損傷小的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到疾病的臨床檢測(cè)中［5-7］。由于采集及處理方式的不同，黏膜分泌物樣本之間存在較大差異。為了保證不同樣本之間具有可比性，許多對(duì)黏膜特異性IgA抗體的研究都以總IgA作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。為定量檢測(cè)豬呼吸道、消化道等黏膜表面的分泌性IgA抗體，本研究利用1株豬IgA單克隆抗體與羊抗豬IgA的多克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，為豬的黏膜免疫研究提供基礎(chǔ)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

140份鼻拭子樣本來自臨床健康豬(明天牧業(yè)有限公司南京六合豬場(chǎng)提供)，陽(yáng)性豬肺泡灌洗液來自臨床健康豬(明天牧業(yè)有限公司南京六合豬場(chǎng)提供)，陰性對(duì)照豬肺泡灌洗液樣本來自剛出生仔豬(未吃初乳)，豬IgA蛋白質(zhì)(由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)［8］，鼠抗豬IgA單抗(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)［8］，96孔酶標(biāo)板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司)，羊抗豬IgA-HRP購(gòu)自BETHYL公司，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker購(gòu)自生興生物公司，其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，微量移液器(Thermo)，高速冷凍離心機(jī)(Sigma)。

1.3 方法

1.3.1 雙抗夾心ELISA方法的建立 以鼠抗豬IgA單抗作包被抗原，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgA抗體作為檢測(cè)二抗，建立豬IgA的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法。以方陣滴定法分別確定包被抗體的最佳稀釋度和工作條件、最適封閉液和作用時(shí)間、酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度和作用時(shí)間、底物溶液的最佳反應(yīng)時(shí)間。建立ELISA的最佳試驗(yàn)條件。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以豬IgA蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)品，將其依次 稀 釋 成 250.0 μg/L、125.0 μg/L、62.5 μg/L、31.3 μg/L、15.6 μg/L、7.8 μg/L、4.0 μg/L、2.0 μg/L、1.0 μg/L、0.5 μg/L，按照已確定的ELISA最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)定樣品稀釋液為陰性對(duì)照，TBST為空白對(duì)照，平行測(cè)定20次。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)IgA的質(zhì)量濃度為自變量，其所對(duì)應(yīng)的OD450值減去空白OD450值為應(yīng)變量，利用ELISACalc數(shù)據(jù)分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低檢測(cè)限和線性范圍。

1.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取3個(gè)批次的豬肺泡灌洗液樣本，同時(shí)進(jìn)行批內(nèi)和批間檢測(cè)，批內(nèi)設(shè)2個(gè)平行。批間設(shè)10個(gè)平行，設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.4 臨床豬鼻拭子中總IgA含量的測(cè)定 用本試驗(yàn)建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法對(duì)140份臨床豬鼻拭子樣本中總IgA含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 雙抗夾心ELISA的工作條件

經(jīng)方陣滴定法優(yōu)化并確定ELISA工作條件:鼠抗豬IgA單抗作包被抗原，包被濃度為 1 μg/ml，每孔 100 μl，37 ℃孵育1 h后4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，每孔加pH 7.4 PBST 350 μl，靜止5 min，然后再甩掉拍干，如此反復(fù)洗滌3次，最后一次拍干后，每孔加1%酪蛋白質(zhì)200 μl，于37℃封閉2 h，如上述方法洗滌3次;每孔加檢測(cè)樣本100 μl(鼻拭子樣本稀釋至1∶500和1∶2 000 2個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔)，37℃作用1 h;洗滌3次后，每孔加入經(jīng)1∶15 000稀釋的羊抗豬IgA-HRP 100 μl，37℃作用1 h。洗滌5次，每孔加100 μl TMB顯色底物，顯色時(shí)間 5 min，最后，每孔加50 μl 2 mol/L H2SO4終止液，讀取OD450數(shù)值。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)對(duì)不同濃度豬IgA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。該曲線為4參數(shù)Logstic擬合;方程:Y=(A－D)/［1+(x/C)^B］+D，其中 A=2.011 18，B= －1.213 78，C=28.741 16，D=0.031 20，R2=0.997 41，從結(jié)果可以看出:最低檢測(cè)限為2.0 ng/ml;檢測(cè)范圍為2.0～250.0 ng/ml。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)抽取3個(gè)批次的豬肺泡灌洗液樣本，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間檢測(cè)。結(jié)果顯示，批內(nèi)試驗(yàn)的變異系數(shù)為0.503%～7.946%;批間試驗(yàn)的變異系數(shù)為0.457% ～4.722%。

2.4 臨床鼻拭子樣本中總IgA含量

用本試驗(yàn)建立的雙抗夾心ELISA方法對(duì)140份鼻拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示鼻拭子總IgA量為(25.84±4.22)μg/ml。

3 討論

本研究建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)豬IgA抗體蛋白質(zhì)，以豬IgA蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各質(zhì)量濃度逐點(diǎn)連接，所得曲線呈弧形分布，曲線中部斜率適中，是最理想的檢測(cè)區(qū)域，所以最后所確定的標(biāo)準(zhǔn)品的最適稀釋比例應(yīng)落在這個(gè)區(qū)域中。最終，本試驗(yàn)建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限為2.0 ng/ml;檢測(cè)范圍為 2.0 ～250.0 ng/ml。

豬呼吸道IgA蛋白質(zhì)雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立及其在豬呼吸道樣本總IgA濃度檢測(cè)中的應(yīng)用為豬黏膜免疫應(yīng)答機(jī)制的研究提供一種可行的檢測(cè)手段。

［1］楊偉平.口腔黏膜免疫研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)空腔醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2001，28(3):183-186.

［2］葛忠源，熊東艷，張啟勇，等.黏膜免疫的研究進(jìn)展［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2008，38(5):44-46.

［3］曾常茜.分泌型IgA在黏膜抗感染中的作用［J］.北華大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，6(1):33-35.

［4］李忠明.當(dāng)代新疫苗［M］.北京:高等教育出版社，2001.

［5］TOM N M，STUART W N，MAIRI C M，et al.Simple methods for measurement of bovine mucosal antibody responses in vivo［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2007，118:160-167.

［6］FABIEN X L，ROBERT E E.Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers［J］.Journal of Immunological Methods，2010，356:6-17.

［7］PER B.Induction of secretary immunity and memory at mucosal surfaces［J］.Vaccine，2007，25:5467-5484.

［8］馮志新，王海燕，劉茂軍，等.豬初乳中SIgA純化及其單抗制備［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27(5):1026-1030.