張雪寒， 何孔旺， 葉 青， 李 彬， 倪艷秀， 溫立斌， 王小敏， 周俊明

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

志賀毒素(Shiga toxin，Stx)又稱(chēng)Vero毒素，是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing E.coli，STEC)重要毒力因子之一，具有細(xì)胞毒性、腸毒性、神經(jīng)毒性作用，是導(dǎo)致被感染者出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀甚至死亡的主要原因，因此，有必要建立敏感而快速的檢測(cè)Stx方法。細(xì)菌培養(yǎng)方法需要耗費(fèi)3 d，而快速檢測(cè)方法如ELISA需要高濃度的病原菌才能檢測(cè)到［1-2］。PCR也是一種快速的檢測(cè)方法，但是一般需要增菌才能檢測(cè)到低濃度的病原菌，并且依賴(lài)于電泳，耗費(fèi)幾個(gè)小時(shí)。近年來(lái)，定量PCR被應(yīng)用于食源性病原的檢測(cè)，敏感性高，但需要專(zhuān)用儀器設(shè)備，定量PCR儀價(jià)格昂貴［3］。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種可對(duì)核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增并廣泛應(yīng)用于病原快速檢測(cè)的一種新型檢測(cè)方法，日本學(xué)者Notomi等［4］發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)2～3對(duì)特異引物(內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，其中環(huán)引物為非必要引物)，在Bst DNA polymerase等溫條件下作用幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。已有學(xué)者將該技術(shù)運(yùn)用到大腸桿菌志賀毒素的檢測(cè)中［5-6］，但一般使用 SYBR Green染料。SYBR Green特異性較差，PCR中只要有擴(kuò)增反應(yīng)，即產(chǎn)生綠色熒光，因此很容易出現(xiàn)非特異性的熒光，影響結(jié)果判斷。本研究擬使用鈣黃綠素作為發(fā)光劑，只有在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才會(huì)產(chǎn)生綠色熒光，較少出現(xiàn)非特異熒光。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品

大腸桿菌O157∶H7 8624(揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng))及其臨床分離株 10個(gè);大腸桿菌 K88、K99、O139、O26、O55以及腸炎沙門(mén)氏菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。另外還有牛糞、豬糞、蔬菜和水果樣品各10份。

1.2 主要試劑與儀器

dNTP(TaKaRa 公司);Bst酶、甜菜堿、Mg2SO4、MnCl2等化學(xué)試劑(南京助研生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品);鈣黃綠素(北京藍(lán)譜有限公司產(chǎn)品);凝膠電泳儀及成像儀(上海培清公司產(chǎn)品);恒溫水浴箱(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品);WH-2微型渦漩混合儀(上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品);Dynabeads anti-E.coli O157免疫磁珠(挪威DYNAL公司產(chǎn)品);2×Taq PCR MasterMix［天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品］。

1.3 引物

參照GenBank中多個(gè)Stx2序列，利用在線生物軟件Primer explorer V4設(shè)計(jì) LAMP引物。F3:5'-CAGTTATACCACTCTGCAACGTG-3';B3:5'-CTGATTCGCCGCCAGTTC-3';FIP:5'-GCTCTTGATGCATCTCTGGTACACTCACTGGTTTCATCATATCTGG-3';BIP:5'-CTGTCACAGCAGAAGCCTTACGGACGAAATTCTCCCTGTATCTGCC-3'。引物由TaKaRa有限公司合成。

1.4 菌株培養(yǎng)

所有細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和營(yíng)養(yǎng)肉湯傳代和增菌。

1.5 DNA 的提取

取1 ml菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清，加入100 μl TE懸浮沉淀，沸水浴10 min，冷卻至室溫，12 000 r/min離心8 min，取上清作為PCR擴(kuò)增模板。

1.6 LAMP檢測(cè)方法的建立

分別優(yōu)化引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，建立LAMP檢測(cè)體系。LAMP檢測(cè)體系為:1×Buffer［Tris-HCl 20 mmol/L，Mg2+8 mmol/L，0.1%Tween-20，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO410 mmol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，甜菜堿 1 mol/L］12.5 μl，內(nèi)引物 50 μmol/L和外引物 5 μmol/L各 1.0 μl，Bst DNA 聚合酶 8 U，DNA 2.0 μl，補(bǔ)水至25.0 μl。反應(yīng)條件為65℃ 50 min，80℃加熱3 min后，加入熒光染料，肉眼觀察結(jié)果。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.7 特異性試驗(yàn)

對(duì)腸炎沙門(mén)氏桿菌及大腸桿菌O139、K88、K99、O26和O55細(xì)菌基因組核酸，按照所建立的LAMP和PCR方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.8 敏感度試驗(yàn)

將大腸桿菌O157∶H7過(guò)夜培養(yǎng)物平板計(jì)數(shù)，定量為1×1010CFU/ml，采用煮沸方法制備模板。將模板10倍系列稀釋至10－10，用所建立的LAMP和PCR方法分別檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7。

1.9 田間應(yīng)用驗(yàn)證

1.9.1 模擬樣品的檢測(cè) 將大腸桿菌O157∶H7過(guò)夜培養(yǎng)物從 10－6至 10－8稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為 104CFU/ml、103CFU/ml和102CFU/ml。分別將0.1 ml稀釋培養(yǎng)物接種到10 g新鮮生牛肉中，制備含有不同濃度病菌的生牛肉樣品。用所建立的LAMP和PCR方法分別檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7。

1.9.2 田間采集樣品的檢測(cè) 牛糞樣品、豬糞樣品、蔬菜樣品和牛肉樣品各10份，用LAMP、PCR和免疫磁珠試劑盒分別檢測(cè)細(xì)菌。LAMP和PCR參照方法1.6，免疫磁珠分離參照Dynabeads anti-E.coli O157免疫磁珠試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴(kuò)增結(jié)果

LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，加入熒光染料，陽(yáng)性管能夠看到明顯的綠色熒光，而陰性管為橙色;瓊脂糖電泳能夠看到清晰的擴(kuò)增條帶。

2.2 LAMP特異性試驗(yàn)

大腸桿菌O157∶H7、O139和O26基因組能夠擴(kuò)增出stx2相應(yīng)大小條帶，相應(yīng)的反應(yīng)管變?yōu)榫G色，其他為陰性。

2.3 LAMP敏感性試驗(yàn)

LAMP檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7純菌的敏感性可以達(dá)到1 CFU/ml，而PCR為 10 CFU/ml。對(duì)模擬的O157∶H7陽(yáng)性樣品檢測(cè)的敏感性可以達(dá)到10 CFU/ml，而PCR為103CFU/ml。

2.4 LAMP檢測(cè)方法驗(yàn)證

牛糞、豬糞、蔬菜和牛肉各10份的LAMP檢測(cè)結(jié)果，2份牛糞和1份荸薺為陽(yáng)性，其余為陰性;PCR檢測(cè)結(jié)果，1份牛糞和1份荸薺為陽(yáng)性，其余為陰性;免疫磁珠分離檢測(cè)結(jié)果，2份牛糞和1份荸薺為陽(yáng)性，其余為陰性。

3 討論

STEC是時(shí)常引發(fā)食源性腹瀉的重要病原菌之一［7］。STEC可以產(chǎn)生兩種毒素，分別為志賀毒素1(Stx1)和志賀毒素2(Stx2)，是引發(fā)出血性腸炎(Hemorrhagic enteritis，HC)和溶血尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)的主要元兇［8］。攜帶Stx2的STECO數(shù)量明顯高于Stx1，并且Stx2能夠分泌到菌體外，有著更嚴(yán)重的致病作用［9-10］。Stx2有多個(gè)變型:Stx2c、Stx2d、Stx2e、Stx2f和 Stx2v，與菌株血清型和致病性有著密切關(guān)系［11］。盡管STEC包括很多的血清型，但目前O157∶H7仍然是最重要的致病血清型，它產(chǎn)生和分泌的Stx2對(duì)人的致病力最強(qiáng)［8］。本研究對(duì)傳統(tǒng)LAMP進(jìn)行改進(jìn)，LAMP擴(kuò)增所需液體預(yù)先配制成預(yù)混液，擴(kuò)增結(jié)束后加入鈣黃綠素顯色觀察。

為了研究 LAMP的敏感性，選用1×1010CFU/ml的O157∶H7純培養(yǎng)物和接種后的牛肉樣品分別進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)模擬制備的牛肉樣品檢測(cè)敏感性略低于純培養(yǎng)物，可能牛肉的雜質(zhì)影響了擴(kuò)增效果，但LAMP的敏感性(10 CFU/ml)還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通PCR(103CFU/ml)。

為研究LAMP的特異性，選用大腸桿菌O157∶H7分離株、豬水腫病代表血清型O139、腸致病性代表血清型O26和O55以及沙門(mén)氏桿菌作為參照。PCR和LAMP檢測(cè)結(jié)果一致:沙門(mén)氏桿菌和腸致病性大腸桿菌O55未擴(kuò)增出任何條帶，顯色反應(yīng)陰性;O139和O26能夠擴(kuò)增出目的條帶，并且顯色反應(yīng)陽(yáng)性。豬水腫病大腸桿菌O139分泌志賀毒素2的變異體Stx2e，能夠被LAMP所擴(kuò)增，說(shuō)明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物適用所有stx2基因，且LAMP特異性良好，不受菌株血清型差異的影響。

為了檢驗(yàn)LAMP的實(shí)用性，采集不同來(lái)源的多份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和免疫磁珠分離。免疫磁珠分離結(jié)果與LAMP一致，但其操作繁瑣，分離后同樣需要進(jìn)一步的PCR鑒定，而LAMP操作方便快捷。PCR在臨床樣品檢測(cè)中，需要增菌后才能夠達(dá)到較好的敏感性。在采集的多種樣品中，糞便中病菌檢出率高于其他樣品，與先前報(bào)道一致［12］，但糞便樣品干擾成分較多，PCR方法檢測(cè)時(shí)，重復(fù)性和檢出率較低;而利用LAMP擴(kuò)增時(shí)，與檢測(cè)其他樣品效果無(wú)明顯差異。

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