汪孟曦，李文蘭，張爭，魏建和，楊云，徐艷紅，梁良

[摘要] 目的：對國產(chǎn)沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）基因AsCHS1編碼區(qū)進行克隆，并對其進行生物信息學分析和表達分析。方法：根據(jù)已報道的白木香傷害轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果分析獲得1條具有查爾酮合酶保守結(jié)構(gòu)域的CHS基因序列，采用RT-PCR技術(shù)，以不同傷害時間白木香木質(zhì)部混合樣品總RNA為模板克隆得到白木香AsCHS1的基因編碼區(qū)序列，并對AsCHS1蛋白進行理化性質(zhì)、蛋白二級結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。另外，采用qRT-PCR方法，以組蛋白（histones）為內(nèi)參對AsCHS1基因在傷害脅迫下的表達模式進行分析。結(jié)果：序列分析表明，所克隆的AsCHS1基因編碼區(qū)開放閱讀框（opening reading frame， ORF）長為1 194 bp，編碼397個氨基酸殘基，命名為AsCHS1。qRT-PCR實驗證明該基因表達量在傷害后12 h最大，說明該基因能夠在早期響應(yīng)傷害脅迫。結(jié)論：白木香AsCHS1基因的編碼區(qū)序列的分離克隆為進一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黃酮合成途徑中的功能及表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 查爾酮合酶；白木香；黃酮合成

國產(chǎn)沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含樹脂的木材。作為我國傳統(tǒng)中藥，沉香有具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用于胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急[1]。沉香為極珍貴芳香類藥材，因其產(chǎn)量低、價格高，遠遠不能滿足市場的需求。沉香葉的資源豐富，探討沉香葉代替沉香藥材的可行性是沉香研究開發(fā)中的一個重要研究方向。通過對沉香葉提取物的化學成分及藥理研究，沉香葉中含有多糖、黃酮、苷類及酚類等化學成分[2-6]，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、止血、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[7]。其中，黃酮類物質(zhì)，如芫花素、木樨草素等均具有藥理活性[8]。合成黃酮類化合物的關(guān)鍵酶之一是查爾酮合成酶（CHS）。通過研究查爾酮合成酶基因的結(jié)構(gòu)，表達方式，在沉香中的黃酮合成和累積等方面，有助于明確白木香沉香中黃酮合成的分子機制，探索利用沉香中CHS基因提高沉香中的黃酮含量的可能性。本研究通過高通量測序獲得CHS基因的cDNA全長序列，對其序列特征進行了生物信息學分析，通過熒光定量PCR技術(shù)研究該基因在處理不同時間的愈傷組織中的表達及積累情況，為進一步研究沉香中黃酮次生代謝調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

2010年5月于海南省?？谑醒葚S鎮(zhèn)采集三年生栽培白木香A. sinensis莖（次生木質(zhì)部已完全分化），經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所魏建和研究員鑒定，憑證標本保存于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所（憑證號2010003）。酒精燈火焰滅菌枝剪，待冷卻后全斷桿傷害處理2，6，12，24 h后，取全斷桿橫切面下1 cm厚的莖，剝?nèi)淦ず罅⒓从靡旱鋬?，存?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌DH Escherichia coli 5α感受態(tài)、Taq Plus DNA Polymerase均購自北京天根生化科技有限公司；Total RNA Purification Kit 購于美國LC Science公司； M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，SYBR Premix Ex Taq，pMD19-T載體均為日本寶生物公司產(chǎn)品。本研究所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成?；驕y序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

PTC-200型梯度PCR擴增儀（Bio-Rad），Nano-Drop 2000核酸/蛋白定量儀（Thermo），臺式高速離心機（Eppendorf），IQ5熒光定量PCR儀（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），制冰機（Sanyo），超低溫冰箱（Sanyo），高壓蒸氣滅菌鍋（Sanyo）。

2 方法

2.1 白木香CHS基因的搜索和分析

張爭等[9]報道了通過高通量測序方法對三年生的白木香傷害轉(zhuǎn)錄組進行了測序拼接，并通過與Swissprot、非冗余核酸數(shù)據(jù)庫（Nt）、非冗余的蛋白數(shù)據(jù)庫（Nr）和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kegg）公共數(shù)據(jù)庫（E≤1×10-5）比對獲得了注釋結(jié)果。根據(jù)KEGG注釋的基因功能信息，對參與次生代謝的序列（按次生代謝物種類） 進行分類。對所有注釋信息整理，搜索黃酮類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。

2.2 白木香總RNA的提取和cDNA合成

取傷害處理的白木香莖，在液氮中研磨，依據(jù)LC Science公司Total RNA Purification Kit試劑盒說明書提取總RNA，利用NanoDrop 2000進行含量測定和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒將白木香總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補鏈DNA （cDNA）。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件及程序均按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行。

2.3 白木香AsCHS1 基因的克隆

從白木香轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果中獲得1個由7條表達序列標簽拼接而成的1 368 bp的序列，經(jīng)注釋分析發(fā)現(xiàn)此片段是具有完整開放閱讀框的CHS基因，其開放閱讀框為1 194 bp，定名為AsCHS1。依據(jù)其兩端序列利用Primer軟件設(shè)計一對引物，序列見表1。以白木香總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照下列體系對白木香的查爾酮合酶基因進行擴增：cDNA 3 μL， 10×Pfu buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol·L^-1） 4 μL，Taq Plus （2.5 U·μL^-1） 1 μL，10 μmol 引物各1 μL，終體積為50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，然后進行30個循環(huán)，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸反應(yīng)10 min，4 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌株，在氨芐抗性平板上進行藍白斑篩選，再經(jīng)PCR檢測后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。

2.4 AsCHS1基因信息學分析

基因的分析工具AsCHS1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）；采用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行二級結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域的三維建模，氨基酸序列比對利用ClustalW方法進行，通過MEGA 4.0構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹。

2.5 白木香AsCHS1基因在不同傷害處理時間的表達分析

利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）的方法檢測白木香愈傷組織中CHS基因在其不同傷害處理時間（對照CK，2，6，12，24 h）的表達情況。分析使用SYBR Green I熒光染料法，在qRT-PCR儀上進行。選取白木香Histone基因[10]作為目標基因定量表達的內(nèi)參基因，引物序列見表1。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。反應(yīng)體系中含有5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上下游引物（10 μmol·L^-1） 各0.5 μL，模板（50 mg·L^-1） 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，總體10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；59 ℃退火/延伸30 s （每次循環(huán)后采集熒光），40個循環(huán)；95 ℃變性10 s，65～95 ℃做熔解曲線分析，每個溫度以每步0.5 ℃上升，每個溫度停留5 s。試驗數(shù)據(jù)通過Excel進行分析，獲得AsCHS1基因的相對表達量。

3 結(jié)果與分析

3.1 白木香AsCHS1基因篩選

基于序列相似性搜索數(shù)據(jù)庫中的序列信息對未知功能的序列進行注釋。對白木香unigenes與核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（SwissProt，KEGG，Nr，Nt）進行BLASTN程序搜索。搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中1條contig12370，長1 247 bp，由7條reads拼接而成，具有完整的蛋白編碼區(qū)，并對其進行了研究。

3.2 白木香AsCHS1 基因的克隆

根據(jù)高通量測序結(jié)果，以白木香的cDNA為模板，利用PCR方法擴增獲得1個1 194 bp的基因序列，397個氨基酸，GenBank登陸號JX573534。白木香CHS基因PCR擴增結(jié)果見圖1。基因命名為AsCHS1，將其連接pMD19-T載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，測序結(jié)果經(jīng)NCBI的Blast比對，確定其擴增產(chǎn)物為白木香CHS基因cDNA的片段。

3.3 白木香AsCHS1 基因編碼蛋白特性分析

3.3.1 理化性質(zhì) 白木香AsCHS1基因全長1 194 bp，編碼397個氨基酸，利用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam對基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行預(yù)測，推測該蛋白的分子式為C1939H3093N521O569S14，相對分子質(zhì)量為43 kD，等電點pI 6.10；帶正電殘基（Arg+Lys）為40，負電殘基（Asp+Glu）為44。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為45.07，脂肪系數(shù)為98.87，親水性系數(shù)為0.014。

3.3.2 二級結(jié)構(gòu)及三級建模 二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果表明，有163個氨基酸參與形成α-螺旋（alpha helix），占所有氨基酸的41.06%，有28個氨基酸參與形成伸展鏈（extended strand），占總氨基酸的9.57%，另有196個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲（random coil），占總氨基酸的49.37%（http：//www.predictprotein.org/）。

利用SWISS-MODEL進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測[11]，通過PyMOL Viewer作圖，三維模型見圖2。用于建立該模型的氨基酸殘基為6～390位，該模型以1cgzA（1.70 A）蛋白[12]為模板，序列同源性為61.8%。

3.4 氨基酸序列比對和基因進化分析

以AsCHS1序列進行Blast在線序列比對，結(jié)果表明AsCHS1基因的核苷酸序列與其他植物CHS基因的相似性較高，利用MEGA 4.0軟件，采用鄰結(jié)法（neighbor-joining， NJ）預(yù)測的白木香AsCHS1與其他代表性植物的氨基酸序列比對，見圖3。結(jié)果顯示，AsCHS1與已獲得的白木香CHS有較高的相似性，與葡萄、擬南芥等植物的CHS蛋白相似性達64%。

3.5 白木香AsCHS1在不同傷害處理時間的表達分析

為研究AsCHS1基因在傷害脅迫下的表達模式，本研究采用qRT-PCR分別檢測對照CK及傷害處理2，6，12，24 h后AsCHS1基因的表達情況，結(jié)果顯示該基因在新鮮愈傷中表達量較低，該基因在傷害處理的24 h內(nèi)表達水平顯著升高，在12 h處基因表達量最高，是對照組表達水平的13.12倍，見圖4。

4 討論

黃酮類化合物是一類天然次生代謝物，廣泛存在于植物中。黃酮在植物的色素積累，抗脅迫，抗菌 及細胞發(fā)育與分化中起著重要作用，同時還具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、保護心腦血管系統(tǒng)等多種生物活性[13]。查爾酮合酶作為黃酮類合成途徑中的關(guān)鍵酶，其基因的突變，沉默或過表達會影響黃酮類物質(zhì)的合成，對其功能和產(chǎn)量產(chǎn)生一定影響。查爾酮合酶基因的表達受植物激素、營養(yǎng)水平、光照、病原菌及機械傷害等的誘導(dǎo)[14]。本實驗以傷害處理的白木香為材料成功克隆了AsCHS1基因全長，并采用生物信息學對其二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等進行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白具有查爾酮合酶典型保守結(jié)構(gòu)域，推測AsCHS1蛋白可能在白木香具有催化合成黃酮的作用，為進一步研究AsCHS1在白木香中黃酮合成途徑中的功能及鑒定酶活性位點奠定基礎(chǔ)。另外，本實驗中qRT-PCR結(jié)果表明AsCHS1基因的表達受傷害脅迫誘導(dǎo)，其表達量在傷害后12 h最大，這為從分子水平上調(diào)控白木香中AsCHS1基因表達量以及提高白木香中黃酮化合物含量提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Cloning and bioinformatics analysis of chalcone synthase

（AsCHS1） gene in Aquilaria sinensis

WANG Meng-xi1，2， LI Wen-lan1， ZHANG Zheng2，3*， WEI Jiang-he2，3， YANG Yun3， XU Yan-hong2， LIANG Liang4

（1.Drug Research Institute of Life Science and Environment Science， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China；

2. Institute of Medicinal Plant Development，National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，

Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；

3. Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medicinal Sciences & Peking Union

Medical College， Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine，

Wanning 571533， China； 4. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）

[Abstract] Objective： The study aimed to clone the open reading frame of chalcone synthase （CHS） from Aquilaria sinensis and analyze the bioinformatics and expression of the gene. Method： One unique sequence containing CHS domain was discovered in our previous reported wound transcriptome dataset of A. sinensis. The open reading frame of CHS was cloned by RT-PCR strategy with the template of mixed RNA extracted from A. sinensis stem which treated by different wound time.The bioinformatic analysis of this gene and its corresponding protein was performed. The AsCHS1 expression in calli was analyzed with histone gene as an internal control gene under wound condition by qRT-PCR technique. Result： One unique sequence of CHS， named as AsCHS1， was cloned from A. sinensis. The full length of AsCHS1 cDNA was containing a 1 192 bp ORF that encoded 397 amino acids. The result of qRT-PCR displayed that the highest expression level was at 12 h， which indicated that it was possibly involved in early-stage response to wound. Conclusion： Cloning and analyzing AsCHS1 gene from A. sinensis provided basic information for study the fuction and expression regulation of AsCHS1 in the flavonoids biosynthesis .

[Key words] chalcone synthase； Aquilaria sinensis； flavonoids biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20130202

[責任編輯 呂冬梅]