水貂阿留申病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備

姜亦飛　于可響　林樹乾等

摘 要：本研究利用PCR方法從水貂阿留申病毒相關(guān)病料中擴(kuò)增出VP2蛋白部分基因，并進(jìn)行原核表達(dá)，成功獲得VP2重組蛋白；利用純化的VP2重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，成功獲得3株雜交瘤細(xì)胞：1F4F7D9、3E9G3D4和4B8B3F8；分別接種小鼠，間接ELISA檢測結(jié)果表明，3組實(shí)驗(yàn)小鼠腹水的單克隆抗體效價(jià)均在106以上。

關(guān)鍵詞：水貂阿留申病毒；VP2重組蛋白；單克隆抗體

水貂阿留申?。ˋleutian mink disease， AD）是一種由阿留申病毒（Aleutian mink disease parvovirus， ADV）引起的水貂自身免疫系統(tǒng)紊亂性疾病，目前在全國范圍內(nèi)廣泛流行，是當(dāng)今阻礙養(yǎng)貂業(yè)發(fā)展的主要傳染病，其主要臨床表現(xiàn)為母貂流產(chǎn)、新生子貂急性肺炎、成年水貂慢性免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎等[1]。病毒粒子中的蛋白分為結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白兩類，其中VP2是ADV的主要免疫原性抗原，是抗原決定簇的載體，與致病性密切相關(guān)，是目前研究最多的蛋白，VP2基因也已成為研究ADV毒力、致病性、抗原性和建立檢測方法的首選基因[2～5]。本研究利用重組表達(dá)的水貂阿留申病毒VP2蛋白制備出單克隆抗體，為阿留申病毒的鑒定、檢測等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水貂阿留申病毒相關(guān)病料、陽性血清由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物教研室提供；骨髓瘤細(xì)胞Ag8.653、BALB/c小鼠由北京青元盛康生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

病毒DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒、IPTG、Ex Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)預(yù)染Marker及非預(yù)染Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗水貂IgG（HRP標(biāo)記）購自美國Sigma-ldrich公司；DAB （3，3二氨基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank收錄的ADV全長序列（JN040434.1），選取VP2基因901～1 560 nt區(qū)域設(shè)計(jì)并合成引物。上游引物5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物5′端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列為：

1.3 VP2基因擴(kuò)增

按照病毒DNA提取試劑盒說明提取病毒DNA，加入滅菌去離子水溶解。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μl，10×PCR buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 2 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，20 μmol/L 上下游引物各1 μl，Ex Taq 0.5 μl，加滅菌去離子水至50 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 min；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)； 72℃延伸10 min。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建

將擴(kuò)增出的VP2基因片段回收并克隆至pMD18-T載體中，用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒命名為pMD18-VP2。用BamHⅠ和XhoⅠ分別雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD18-VP2和pET-28a（+）載體，回收目的片段，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pET28a-VP2。將陽性質(zhì)粒pET28a-VP2轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送上海博尚生物工程有限公司測序。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blotting分析

挑取陽性菌于37℃培養(yǎng)待OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h。取誘導(dǎo)的菌體，用1×PBS緩沖液懸浮，利用超聲波破碎菌體，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白表達(dá)情況。設(shè)置pET-28a（+）空載體轉(zhuǎn)化株作為對照。

取100 ml經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的VP2蛋白菌液，按照Ni-NTA SefinoseTM Resin Kit說明書進(jìn)行純化，然后根據(jù)Sambrook等[6]方法進(jìn)行Western blotting分析，最后加入DAB底物液顯色并拍照。

1.6 單克隆抗體的制備

1.6.1 重組VP2蛋白的準(zhǔn)備 誘導(dǎo)表達(dá)的VP2蛋白經(jīng)Ni柱純化后，定量，備用。

1.6.2 免疫小鼠 取健康8周齡BALB/c小鼠5只，足掌注射VP2蛋白免疫，共五次，劑量均為100 μg，首免與等體積弗氏完全佐劑乳化，二免與等體積弗氏不完全佐劑乳化，三、四、五次免疫不用佐劑。首免與二免間隔20 d，二免與三免間隔10 d，第三、四、五次免疫間隔3～7 d不等。五次免疫3 d后尾靜脈采血，利用以表達(dá)的VP2蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法測定靜脈血中的抗體效價(jià)，選效價(jià)高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)。

1.6.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立 分離免疫小鼠的脾臟并勻漿制備免疫脾細(xì)胞，按常規(guī)方法將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合；融合后7～10 d補(bǔ)加1%的HT培養(yǎng)液，用倒置顯微鏡觀測細(xì)胞生長情況及有無雜交瘤形成，并作記錄；待集落長到培養(yǎng)孔的1/4～1/3時(shí)進(jìn)行抗體檢測，檢測到陽性孔（即能在其上清液中檢測到特異性抗體）時(shí)，作克隆化培養(yǎng)；當(dāng)陽性孔中的細(xì)胞集落很大時(shí)，吸出，移入已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)（陽性克隆的篩選采用以表達(dá)的VP2蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法；陽性孔的克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法）。

1.6.4 小鼠腹水型單克隆抗體的生產(chǎn) 選取8～10周齡健康純系雌性BALB/c小鼠12只，設(shè)3個(gè)雜交瘤細(xì)胞組和1個(gè)對照組，每組3只，于接種細(xì)胞前10 d注射無菌液體石蠟，每只0.5 ml；將雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上吹下，培養(yǎng)物移入50 ml離心管中，室溫800×g離心5 min，棄上清；用40 ml無菌PBS重懸細(xì)胞，離心，棄上清；重懸細(xì)胞于5 ml無菌PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力是否接近100%；加入無菌PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，向小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 ml細(xì)胞懸液，5 d后開始采集腹水；腹水于室溫下1 500×g離心10 min，收集上清轉(zhuǎn)移至高速離心管，4℃下15 000×g離心10 min，收集上清，標(biāo)記好單抗名稱和采集日期，-80℃保存。

腹水效價(jià)的測定：腹水從1∶200開始倍比稀釋，利用以表達(dá)的VP2蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法測定抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP2基因擴(kuò)增

提取水貂阿留申病毒DNA，以此為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條大小為660 bp左右的片段（圖1），與預(yù)期大小相符。

2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blotting分析

重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，獲得高效表達(dá)，在沉淀中出現(xiàn)30.2 ku左右的目的蛋白條帶（圖4），大小與預(yù)期結(jié)果相符。純化蛋白經(jīng)Western blotting分析（圖5），與水貂阿留申病毒陽性血清呈特異性反應(yīng)，證明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。

2.5 單克隆抗體的制備

細(xì)胞融合后，通過ELISA方法篩選到3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗阿留申病毒VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別為1F4F7D9、3E9G3D4、4B8B3F8。將這3株雜交瘤細(xì)胞分別注入小鼠腹腔制備腹水，經(jīng)ELISA檢測，3組實(shí)驗(yàn)小鼠腹水的單克隆抗體間接ELISA效價(jià)均在106以上。

3 討論

由于ADV分離十分困難，筆者嘗試過多次病毒分離，但一直未能分離到病毒。因此，采用直接從ADV陽性病料擴(kuò)增VP2基因的方法，成功擴(kuò)增出VP2部分基因，并將其克隆至表達(dá)載體pET-28a（+）中進(jìn)行表達(dá)，成功獲得重組VP2蛋白，經(jīng)Western-blotting證明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

目前，阿留申病毒病作為危害世界養(yǎng)貂業(yè)的三大病毒性傳染病之一，在我國許多地區(qū)都有不同程度的流行，給我國的養(yǎng)貂業(yè)帶來了很大的損失[7]，因此建立敏感、特異、低成本、高通量的血清學(xué)檢測方法，用來篩選淘汰發(fā)病水貂，建立非感染貂群顯得尤為重要。對流免疫電泳（CIEP）是世界公認(rèn)的、應(yīng)用最廣泛的AD檢測方法，但CIEP中的抗原多是臟器抗原、細(xì)胞抗原等病毒抗原，病毒的濃縮和純化成本較高，且存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，在應(yīng)用中有一定的局限性[8]。本研究利用純化的VP2重組蛋白免疫BALB/c小鼠，篩選到3株雜交瘤細(xì)胞，并獲得3組單克隆抗體ELISA效價(jià)均在106以上的實(shí)驗(yàn)小鼠的腹水，為以單克隆抗體為基礎(chǔ)建立高效的ELISA檢測阿留申病毒的方法奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 鄭 全， 王樹志， 王全凱. 水貂阿留申病研究進(jìn)展[J]. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2002， 6（4）：49-52.

[2] 梁冬瑩， 華育平， 曾祥偉. 水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 35（6）：39-41.

[3] McKenna R， Olson N H， Chipman P R， et al. Three-dimensional structure of Aleutian mink disease parvovirus： implications for disease pathogencity[J]. J. Virol.， 1999， 73（8）：6882-6891.

[4] Bloom M E， Alexandersen S， Garon C F. Nucleotide sequence of the 5′-terminal palindrome of Aleutian mink disease parvovirus and construction of an infectious molecular clone [J]. J. Virol.， 1990， 64（7）：3551-3556.

[5] Wu W H， Bloom M E， Berry B D， et al. Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in abaculovirus expression system for potential diagnostic use[J]. J. Vet. Diagn. Invest.， 1994， 6（1）：23-29.

[6] Sambrook J， Fritsch E F， Maniatis T， 著. 金冬雁， 黎孟楓， 侯云德， 等譯. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第二版）[M]. 北京：科學(xué)出版社， 1998， 862-897.

[7] 殷 震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)（第二版）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1997，1162-1165.

[8] 閆喜軍，籍玉林. 我國水貂阿留申病流行現(xiàn)狀、特點(diǎn)及防治技術(shù)[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2004， 5：44.