郭玉平等

摘要：本研究運(yùn)用多種軟件對(duì)12種作物的 FAD2基因進(jìn)行密碼子偏好性分析。結(jié)果表明：FAD2基因在12種作物中密碼子使用偏好性差異很大，禾本科作物玉米、水稻、高粱的FAD2基因有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codons， ENC）在30左右，為偏好性很強(qiáng)的基因；油料作物油菜和亞麻的FAD2基因的ENC值分別為45.49和48.58，為一般偏好性基因；另外6種油料作物和模式植物擬南芥的FAD2基因ENC值都大于50，偏好性較弱。玉米、水稻、高粱、油菜、亞麻、花生和擬南芥的FAD2基因偏好以G或C堿基結(jié)尾的密碼子，其余5種油料作物的FAD2基因偏好使用以A或T結(jié)尾的密碼子。在12種作物中，密碼子CTC的RSCU值都大于1，屬于高頻使用的密碼子；而CTA、ATA、GTA、AGT、CCC屬于低頻密碼子。在聚類分析中，12種作物基于FAD2基因密碼子用法與基于CDS序列的聚類結(jié)果大體一致。

關(guān)鍵詞：FAD2基因；密碼子偏好性

中圖分類號(hào)：Q755文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）07-0024-06

脂肪酸脫氫酶（Fatty Acid Desaturase， FAD2）是存在于作物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的一種脫氫酶，可以向油酸（C18∶1）引入第二個(gè)雙鍵，提供質(zhì)膜結(jié)構(gòu)所需的亞油酸（C18∶2）等多元不飽和脂肪酸，是作物產(chǎn)生多聚不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶。不飽和脂肪酸在增加生物膜的流動(dòng)性中發(fā)揮重要作用，其在生物膜中的含量和作物的抗寒性、抗高溫性、以及抗病性等有極其重要的作用；在人和動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)揮著重要作用，包括脂類代謝、心血管功能調(diào)節(jié)、血糖濃度調(diào)節(jié)、癌細(xì)胞調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、對(duì)視力和腦的發(fā)育調(diào)控、骨質(zhì)形成的調(diào)控等各個(gè)方面^[1]。由于FAD2只存在于作物和微生物中，人體細(xì)胞中沒有FAD2基因，自身不能合成α-亞麻酸（ALA）、γ-亞麻酸（GLA）等多不飽和脂肪酸，必須從食物中攝取^[2]。

目前，擬南芥^[3]、油菜^[4]、大豆^[5]等多種植物的FAD2基因已被克隆并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的研究。本研究分析了棉花、花生、油菜、大豆、蓖麻、亞麻及千年桐、油桐等8種油料作物的FAD2基因的密碼子使用特征，并與模式植物擬南芥和禾本科植物玉米、水稻、高粱進(jìn)行比較。根據(jù)FAD2基因密碼子的RSCU（Relative Synonymous Codon Usage）值對(duì)12種作物進(jìn)行了聚類分析，并將其聚類結(jié)果與基于FAD2基因CDS（Coding DNA Sequences）序列的聚類結(jié)果做了比較。了解FAD2基因的密碼子在各個(gè)作物中的使用特性，為進(jìn)一步深入研究FAD2基因及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制等提供重要理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1序列來源

本研究使用的FAD2基因蛋白編碼序列（CDS）來源于GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） ，不同作物的FAD2基因在數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)見表1。

1.2分析方法

1.2.112種作物的FAD2基因同義密碼子堿基組成及偏好性分析運(yùn)用Codon W1.4.2軟件（http：//codonw.sourceforge.net/）對(duì)12種作物的FAD2基因的CDS序列進(jìn)行分析，分別計(jì)算每條序列同義密碼子的相對(duì)使用度、有效密碼子數(shù)、GC及GC3s含量。并利用Mobyle在線工具（http：//mobyle.pasteur.fr）中的CUSP計(jì)算GC1s和GC2s含量。

（1） 同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）是對(duì)同義密碼子使用偏愛性的評(píng)估，定義為某一同義密碼子使用次數(shù)的觀察值與該密碼子出現(xiàn)次數(shù)的期望值的比值。如果密碼子的使用無偏愛性，則 RSCU值為1；如果某一密碼子使用頻繁，則RSCU值大于1；如果某一密碼子使用頻率低，則RSCU值小于1。RSCU值直觀地反映了密碼子使用的偏好性^[6]。

（2） 有效密碼子數(shù)（ENC）反映基因密碼子使用的偏愛程度，取值范圍為20（每個(gè)氨基酸只使用一個(gè)密碼子）～61（各個(gè)密碼子被均衡使用），其值越小，表明該基因的密碼子使用偏好性越強(qiáng)^[7]。

（3） 密碼子的組成度量指標(biāo)包括GC（鳥嘌呤和胞嘧啶）、GC1s（同義密碼子第1位的鳥嘌呤和胞嘧啶）、GC2s（同義密碼子第 2 位的鳥嘌呤和胞嘧啶）、GC3s（同義密碼子第 3 位的鳥嘌呤和胞嘧啶）含量。

1.2.2基于密碼子RSCU值及CDS序列的聚類分析利用SAS 8.1軟件（Institute Inc.， Cary， North Carolina， USA）編程，以每條基因作為研究對(duì)象，將59個(gè)密碼子（去除3個(gè)終止密碼子和2個(gè)只編碼Trp、Met的密碼子）的RSCU值作為變量，根據(jù)其相對(duì)使用度之間的歐氏距離，采用系統(tǒng)聚類法中的最大距離法進(jìn)行聚類，并對(duì)12種作物FAD2基因密碼子偏好性進(jìn)行比較分析。

利用MEGA5.10軟件（http：//www.megasoftware.net/mega.php）中的ClustalW模塊對(duì)FAD2的CDS序列進(jìn)行多序列比對(duì)^[8]，然后采用UPGMA法對(duì)FAD2基因CDS序列進(jìn)行聚類分析^[16]。

2結(jié)果與分析

2.1有效密碼子數(shù)及堿基組成分析

12種作物FAD2基因的ENC值、GC堿基含量以及密碼子第一、二、三位的GC堿基含量計(jì)算結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：在12種作物中，F(xiàn)AD2基因ENC值差異很大，其中玉米、水稻、高粱FAD2基因的ENC值均在30左右，表明它們具有較強(qiáng)的密碼子使用偏好性；油菜和亞麻FAD2基因的ENC值分別為45.49和48.58，說明它們的密碼子偏好性比禾本科作物要弱些，為一般偏好性基因；剩余6種油料作物FAD2基因的ENC值均大于50，說明它們的密碼子使用偏好性很弱。進(jìn)一步分析12種作物FAD2基因GC含量及密碼子第一、二、三位的GC含量，發(fā)現(xiàn)玉米、水稻、高粱、油菜、亞麻、擬南芥FAD2基因GC含量呈現(xiàn)GC3s>GC1s>GC2s這一規(guī)律。除擬南芥外，它們的GC含量都大于50%，分別為67.18%、65.81%、62.89%、55.06%、54.53%。陸地棉、花生、大豆、蓖麻、千年桐、油桐FAD2基因GC含量呈現(xiàn)GC1s>GC3s>GC2s規(guī)律，且它們的GC含量都小于50%，分別為45.45%、48.00%、46.48%、46.35%、45.05%、44.79%?；ㄉ⒂筒?、亞麻、玉米、水稻、高粱以及擬南芥FAD2基因的GC3s含量都大于50%，說明這7種作物FAD2基因在編碼時(shí)偏好使用G或C結(jié)尾的密碼子。陸地棉、大豆、蓖麻、千年桐、油桐FAD2基因的GC3s含量小于50%，說明這5種作物FAD2基因在編碼時(shí)偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子。

2.2FAD2基因密碼子使用特性分析

用CodonW1.4.2軟件計(jì)算12種作物FAD2基因密碼子的RSCU值（表3）。在12種作物中，密碼子CTC的RSCU值都大于1，屬于共同偏好使用的密碼子，而密碼子CTA、ATA、GTA、AGT、CCC的 RSCU值小于1，屬于使用頻率較低的密碼子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，密碼子ATC、AAG的RSCU值分別只在大豆、棉花中小于1，在其他11個(gè)作物中都是高頻使用的密碼子；密碼子CTG、GCG在玉米、水稻、高粱中高度偏好使用，但在8種油料作物和擬南芥中RSCU值都小于1；TCC只在兩種木本油料作物中是低頻密碼子。

綜上，F(xiàn)AD2基因在12種作物中，每個(gè)氨基酸在同義密碼子使用上都存在著明顯的不同，每種作物都有自己偏好使用的密碼子。在基因工程中可以根據(jù)每種作物FAD2基因的密碼子使用特征來設(shè)計(jì)基因序列，優(yōu)化基因密碼子，盡量避免使用頻率低的密碼子，使外源基因在受體物種中能夠高效穩(wěn)定地表達(dá)。

2.3基于密碼子用法和CDS序列的聚類分析

基于FAD2基因密碼子用法的聚類結(jié)果見圖1。12種作物可以分為兩大類，第一大類包括8種油料作物和擬南芥。其中，屬于油桐屬的油桐、千年桐最先聚在一起，后與同為大戟科的蓖麻聚為一小類；屬于蝶形花科的花生、大豆單獨(dú)聚為一小類；油菜和擬南芥為十字花科作物，油菜先與亞麻聚在一起，后與擬南芥聚為一類。另一大類包括3種禾本科作物玉米、水稻、高粱。這一結(jié)果與FAD2基因基于CDS序列的聚類結(jié)果（圖2）基本相符。由此可見，F(xiàn)AD2基因密碼子偏好性差異大小與物種的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有關(guān)，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，基因密碼子偏好性差異越大，親緣關(guān)系越近，密碼子偏好性差異越小?；贔AD2基因密碼子用法的聚類能很好地反映出植物之間的親緣關(guān)系。

3討論

影響密碼子使用偏好性的因素很多，如基因堿基組成、表達(dá)水平等^[9，10]，許多研究都表明禾本科作物GC含量高，雙子葉作物GC含量低^[11，12]。禾本科作物少用或避免使用以A或T結(jié)尾的密碼子，偏好于使用以G或C結(jié)尾的密碼子，而雙子葉作物則相反^[13，14]。本研究對(duì)8種油料作物（雙子葉）、3種禾本科作物（單子葉）和擬南芥（雙子葉）共12種作物的FAD2基因分析發(fā)現(xiàn)，玉米、水稻、高粱3種禾本科作物FAD2基因GC含量都超過了60%，比雙子葉作物高，和前人研究結(jié)果一致^[15，16]。但油料作物油菜、亞麻雖為雙子葉作物，GC含量在55%左右，超過了50%，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果不符^[15，16]，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于與前人分析的基因及作物不同造成的。進(jìn)一步從ENC值和GC3s含量上看，玉米、水稻、高粱的GC3s含量都很高，玉米、水稻都在95%以上，高粱為87.37%，油菜和亞麻GC3s也在70%左右；同時(shí)玉米和水稻的ENC值都小于30，高粱的為35.48，油菜和亞麻分別為45.49和48.58，由此可知玉米、水稻、高粱、油菜、亞麻密碼子偏好性較強(qiáng)或一般。因此推測，GC堿基含量的多少可能會(huì)導(dǎo)致FAD2基因密碼子偏好性的強(qiáng)弱。

密碼子作為聯(lián)系核酸和蛋白質(zhì)的紐帶，可用來推測基因組內(nèi)部或基因組間的演化關(guān)系，即不同作物的同一基因或同一作物的不同基因?qū)γ艽a子的用法特征有所不同，這種密碼子使用偏好性差異大小與作物的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有關(guān)，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，密碼子偏好性差異越大，親緣關(guān)系越近，密碼子偏好性差異越小^[17]。對(duì)8種油料作物、3種禾本科作物和擬南芥FAD2基因密碼子用法進(jìn)行了聚類分析，并與基于FAD2基因CDS序列的聚類分析進(jìn)行了比較。兩種方法的聚類結(jié)果對(duì)比顯示，12種作物親緣關(guān)系大體上是一致的，驗(yàn)證了前人的結(jié)論：在基因類型和功能一定的情況下，進(jìn)化上親緣關(guān)系較近的作物間，同義密碼子的用法相似^[15]。兩種聚類結(jié)果有一些作物在位置上存在差異，這種現(xiàn)象在前人的研究中也出現(xiàn)過^[16]，比如玉米、水稻、高粱三者之間的親緣關(guān)系，從基因組學(xué)上來說^[18]，玉米與高粱的親緣關(guān)系更近一些，但在基于FAD2基因密碼子用法的作物聚類分析中，玉米先與水稻聚在一起，后又與高粱聚為一類；油菜和擬南芥為十字花科作物，亞麻屬于薔薇亞綱作物，從親緣關(guān)系上來說，油菜與擬南芥應(yīng)更近一些，但在FAD2基因密碼子用法上，油菜與亞麻比擬南芥要近些；而蝶形花科的花生與大豆的FAD2基因，在密碼子使用上很相似，但在FAD2基因CDS序列上存在較大的差異。出現(xiàn)這些現(xiàn)象可能是由于本研究只選取了一個(gè)FAD2基因，分析的作物種類也太少，在統(tǒng)計(jì)計(jì)算上可能出現(xiàn)一些誤差。單基因在進(jìn)化上也可能存在較大的突變，導(dǎo)致其密碼子使用偏好性發(fā)生較大變化，因而表現(xiàn)出與真實(shí)的分類地位不同^[15]。如果多選用一些基因，作物基于密碼子用法的聚類分析和基于基因CDS序列的聚類分析可能更接近于真實(shí)的系統(tǒng)分類。目前在基于分子序列的系統(tǒng)發(fā)育分析中，基于編碼區(qū)密碼子用法的聚類分析可為系統(tǒng)發(fā)育分析提供可靠信息，可作為各種系統(tǒng)發(fā)育分析方法的重要補(bǔ)充，用于作物進(jìn)化關(guān)系和分子進(jìn)化機(jī)制研究。

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