李龍虎等

【摘要】 目的 探討抑制磷酸二酯酶5的短發(fā)夾RNA重組腺病毒載體PDE5 shRNA對(duì)缺氧缺糖條件下乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 培養(yǎng)新生C57BL/6J小鼠心肌細(xì)胞，通過(guò)缺氧缺糖，建立小鼠心肌細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型，分實(shí)驗(yàn)組（shPDE5）和對(duì)照組（Null），實(shí)驗(yàn)組：通過(guò)構(gòu)建抑制磷酸二酯酶5的短發(fā)夾RNA重組腺病毒載體（PDE5 shRNA），將PDE5 shRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，對(duì)照組（Null）：將沒(méi)有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。利用TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 與對(duì)照組比較，細(xì)胞在缺氧缺糖條件下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 PDE5 shRNA可明顯拮抗缺氧缺糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 短發(fā)夾RNA；干預(yù)治療；磷酸二酯酶5；心肌細(xì)胞

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.035 文章編號(hào)：1004-7484（2013）-06-2893-02

病理性細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞喪失的形式之一，是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)[1]。心肌細(xì)胞凋亡既是心肌細(xì)胞損傷的一種反應(yīng)，同時(shí)又是心功能受損的一個(gè)重要參與因素。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡，可能會(huì)減輕心室重構(gòu)，減輕心肌纖維化，改善心臟功能，抗細(xì)胞凋亡成為心力衰竭生物治療的一個(gè)新方向。越來(lái)越多的證據(jù)表明PDE5與心血管系統(tǒng)疾病有密切的關(guān)系。最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表達(dá)增加，并且會(huì)加重心衰患者的心室重構(gòu)，可能是由于cGMP/PKG信號(hào)的下降，加劇心功能惡化[2]。RNA干擾是近年發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，能特異性地抑制靶基因的表達(dá)，具有快速、高效、容易操作、序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建磷酸二酯酶5的短發(fā)夾RNA重組腺病毒載體（PDE5 shRNA），研究其對(duì)缺氧缺糖條件下乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生C57BL/6J小鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002），用于乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)。

藥品與試劑DMEM培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自Promega公司，cGMP、PKG試劑盒購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司。

1.2 方法 shRNA重組腺病毒載體構(gòu)建我們根據(jù)鼠的PDE5A序列設(shè)計(jì)PDE5短發(fā)卡RNA，兩個(gè)互補(bǔ)PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根據(jù)鼠PDE5序列設(shè)計(jì)并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈并克隆進(jìn)入載體pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，獲得鼠PDE5的shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后將供體注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV，獲得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，沒(méi)有插入shRNA的普通腺病毒載體作為對(duì)照組（Null），然后將攜帶有PDE5 shRNA的腺病毒載體（shPDE5）和普通的腺病毒載體（Null）分別轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，放在DMEM和10% FBS混合培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過(guò)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增病毒，并經(jīng)離心、提取、純化制備高滴度重組腺病毒載體。

準(zhǔn)備和培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的心肌細(xì)胞按照文獻(xiàn)[6]從一日齡C57BL/6J小鼠提取心肌細(xì)胞，在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行心肌細(xì)胞的鑒定。

分組及給藥分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組（shPDE5）用濃度1X106個(gè)/ml的PDE5shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，對(duì)照組（Null）轉(zhuǎn)染等量未攜帶PDE5shRNA的腺病毒載體（Null），在正常條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)16小時(shí)候在激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定。

1.3 原位末端標(biāo)記分析（TUNEL） 正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，用缺糖Hanks液代替正常培養(yǎng)基，放在37°C飽含95%N2/5%CO2密閉容器中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)8小時(shí)之后，利用原位末端標(biāo)記分析對(duì)各組心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSSl7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較用單因素方差分析（one—wayANOVA），P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 PDE5shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)鑒定 經(jīng)PDE5 shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)16小時(shí)以后，實(shí)驗(yàn)組大多數(shù)細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色，證明PDE5 shRNA腺病毒載體轉(zhuǎn)到心肌細(xì)胞是成功的（圖1）。

2.2 TUNEL陽(yáng)性檢測(cè) 細(xì)胞在缺氧缺糖條件下培養(yǎng)8小時(shí)后進(jìn)行TUNEL分析顯示，實(shí)驗(yàn)組的心肌細(xì)胞在缺氧缺糖條件下能夠耐受細(xì)胞損傷，而對(duì)照組細(xì)胞對(duì)細(xì)胞損傷很敏感，細(xì)胞在缺氧缺糖條件下培養(yǎng)8小時(shí)之后，與實(shí)驗(yàn)組比較，對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性心肌細(xì)胞明顯增加（圖2）。

3 討 論

RNA干擾是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）時(shí)，通過(guò)dsRNA介導(dǎo)特異性的使內(nèi)源性mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默[6-7]。由RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生的RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用靶目標(biāo)PDE5的短發(fā)夾RNA（PDE5 shRNA）對(duì)缺氧缺糖條件下心肌細(xì)胞干預(yù)治療，通過(guò)抑制PDE5的表達(dá)明顯拮抗缺氧缺糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。這些觀察結(jié)果與早先的報(bào)道一致，即PDE5抑制劑西地那非可以拮抗心肌局部缺血引起的心肌細(xì)胞凋亡[8]，有研究者提出，cGMP/PKG信號(hào)通路在PDE5抑制劑抗心肌細(xì)胞凋亡方面起到非常重要的作用[9-10]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，經(jīng)過(guò)PDE5 shRNA 干預(yù)，細(xì)胞凋亡明顯減輕，這些都高度提示cGMP/PKG信號(hào)通路在減少細(xì)胞凋亡方面起到核心作用。

總之，PDE5 shRNA明顯拮抗缺氧缺糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，通過(guò)持續(xù)抑制心肌細(xì)胞PDE5基因表達(dá)對(duì)缺氧缺糖條件下心肌細(xì)胞發(fā)揮顯著的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Lockshin RA.Programmed cell death：history and future of a Concept[J].J Soc Biol，2005，199（3）：169-173.

[2] Pokreisz P，Vandenwijngaert S，Bito V，et al.Ventricular phosphodiesterase-5 expression is increased in patients with advanced heart failure and contributes to adverse ventricular remodeling after myocardial infarction in mice[J].Circulation，2009，（119）：408-416.

[3] Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature，2001，409（6818）：363-366.

[4] Nishikura K.A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst[J].Cell，2001，107（4）：415-418.

[5] Wang L，F(xiàn)eng ZP，Kondo CS，et al.Developmental changes in the delayed rectifier K+ channels in mouse heart[J].Circ Res，1996，（79）：79-85.

[6] Hannon GJ.RNA interference[J].Nature，2002，（418）：244–251.

[7] Grimm D，Streetz KL，Jopling CL，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways[J].Nature，2006，（441）：537–541.

[8] Das A，Xi L，Kukreja RC.Phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil preconditions adult cardiac myocytes against necrosis and apoptosis.Essential role of nitric oxide signaling[J].J Biol Chem，2005，（280）：12944-12955.

[9] Fiedler B，F(xiàn)eil R，Hofmann F，Willenbockel C，Drexler H，Smolenski A，Lohmann SM，Wollert KC.cGMP-dependent protein kinase type I inhibits TAB1-p38 mitogen-activated protein kinase apoptosis signaling in cardiac myocytes[J].J Biol Chem，2006，（281）：32831-32840.

[10] Das A，Xi L，Kukreja RC.Protein kinase G-dependent cardioprotective mechanism of phosphodiesterase-5 inhibition involves phosphorylation of ERK and GSK3beta[J].J Biol Chem，2008，（283）：29572-29585.