李龍虎等

【摘要】 目的 探討PDE5 shRNA對小鼠急性心梗后早期細胞凋亡的影響。方法 通過結(jié)扎小鼠左冠狀動脈前降支建立小鼠心肌梗死模型，隨機分為實驗組（n=10）：將攜帶有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重組腺病毒載體注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)和對照組（n=10）：將沒有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒載體注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)。一周后，進行免疫組化和TUNEL分析檢測梗死及梗死周邊細胞凋亡情況。結(jié)果 心梗1周后，和對照組相比較，實驗組小鼠梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)域細胞凋亡明顯減少（P<0.05），梗死周邊心肌細胞凋亡明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 PDE5 shRNA的干預(yù)可以明顯減少心肌梗死及梗死周邊區(qū)細胞凋亡和非梗死區(qū)心肌細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 短發(fā)夾RNA；干預(yù)治療；心肌梗死；磷酸二酯酶5抑制劑

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.061 文章編號：1004-7484（2013）-06-2921-02

近年來，隨著心肌梗死存活率的大幅提高，心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病率和死亡率都呈明顯上升趨勢[1]，已逐漸成為全世界范圍主要的發(fā)病和死亡原因之一，如何降低心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病率和死亡率，是心血管病防治領(lǐng)域中的關(guān)鍵問題。盡管有一系列的治療措施，心衰患者的預(yù)后仍不盡人意[2]。心肌梗死后心肌細胞凋亡是觸發(fā)心室重構(gòu)導(dǎo)致心力衰竭的重要原因，阻止梗死后心肌細胞凋亡可以減少心室重構(gòu)，改善心功能[3]。早期干預(yù)有助于延緩心梗后心衰的進展，對心梗的遠期預(yù)后有不可估量的益處。

最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表達增加，并且會導(dǎo)致心梗后心室重構(gòu)[4]，可能是由于cGMP/PKG信號的下降，加劇心功能惡化。PDE5抑制劑對心臟有很多益處，通過持續(xù)抑制磷酸二酯酶可以減輕心肌梗死引起的心室重構(gòu)和心功能惡化，本實驗主要通過研究長效磷酸二酯酶5抑制劑短發(fā)夾RNA（PDE5 shRNA）重組腺病毒載體對小鼠急性心肌梗死模型心肌細胞凋亡的影響并探討其可能的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性10周齡C57BL/6J小鼠（由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（遼）2008-0002），體重25-35g。

1.2.2 藥品與主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、10%FBS（Sigma公司）；Desmin一抗（SantaCruz）；TUNEL試劑盒（Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 PDE5shRNA重組腺病毒載體的建立 根據(jù)小鼠的PDE5A序列設(shè)計PDE5短發(fā)卡RNA，兩個互補PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根據(jù)鼠PDE5序列設(shè)計并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈并克隆進入載體pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，獲得鼠PDE5的shRNA表達載體質(zhì)粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后將供體注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV 獲得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，沒有插入shRNA的普通腺病毒載體作為對照組，然后將攜帶有PDE5 shRNA和沒有PDE5 shRNA普通的腺病毒載體分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，放在DMEM和10% FBS混合培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過HEK293細胞擴增病毒，并經(jīng)離心、提取、純化制備高滴度重組腺病毒載體。

1.2.2 動物模型的制備及分組 實驗用雄性C57BL/6J小鼠若干只，按照文獻[5]的方法結(jié)扎冠狀動脈前降支復(fù)制小鼠心梗模型，并將建立好的模型隨機分為實驗組（n=10）：將攜帶有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重組腺病毒（1x1010粒子/小鼠）注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)和對照組（n=10）：將沒有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒載體以同樣的方法注射到心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)。隨后逐層關(guān)胸。手術(shù)嚴格無菌操作。

1.2.3 組織標本處理 心臟標本的留取一周后，所有存活小鼠麻醉狀態(tài)下，迅速取出心臟，冰生理鹽水沖洗干凈，垂直心臟長軸將其評分為2段，部分心肌置入4%多聚甲醛溶液中固定，部分放置-80℃冰箱低溫保存。

1.2.4 細胞凋亡原位檢測 對梗死及梗死周邊細胞采用TUNEL法檢測，按照說明書操作，光鏡下（20×20倍）觀察，陽性細胞核為紅色，隨機選擇5個無重疊視野，分別記數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，二者百分比作為凋亡指數(shù)；隨后對梗死周邊心肌細胞采用雙免疫熒光標記檢測，首先以Desmin抗體為一抗進行染色，用TUNEL檢測心肌細胞凋亡情況，DAPI用于著色細胞核，光鏡下（20×20倍）觀察，心肌細胞為綠色，陽性細胞核為紅色，隨機選擇5個無重疊視野，分別記數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，二者百分比作為凋亡指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差（χ±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠細胞凋亡的情況 TUNEL（原位末端標記法）分析顯示，與對照組比較，實驗組梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)細胞凋亡數(shù)目減少（圖1），這表明，PDE5 hRNA明顯降低細胞凋亡發(fā)生率。

2.2 各組小鼠梗死周邊心肌細胞凋亡的情況 與對照組比較，實驗組小鼠梗死周邊心肌細胞凋亡數(shù)目明顯減少（圖2），這表明，PDE5 shRNA明顯降低心肌細胞凋亡發(fā)生率。

3 討 論

心肌細胞凋亡是急性心肌梗死、心室重塑的重要病理改變，是導(dǎo)致心肌細胞減少的主要原因，從而造成心肌功能和結(jié)構(gòu)的損害[6]。本實驗利用靶向磷酸二酯酶5的短發(fā)夾RNA（PDE5 shRNA）對急性心梗干預(yù)治療，可以明顯降低PDE5基因表達、降低細胞凋亡發(fā)生率。

隨著哺乳動物進化的演變，RNA干擾是一種固有的生物學現(xiàn)象[7]。生物學上，RNA干擾對短期和長期阻斷蛋白表達有很重要的生理意義[8]。早先有報道稱shRNA質(zhì)?？梢栽隗w內(nèi)保持1-4周的活性時間[9]，將shRNA作為一些特殊基因表達的靶基因，可能成為人類用作長期預(yù)防一個非常有效的策略。于當今治療心臟疾病的策略相比，這一新策略不用反復(fù)吃藥就能提供長期有效地預(yù)防保護作用。在這項研究中，我們選擇PDE5作為目標。PDE5在組織和肺血管系統(tǒng)中對平滑肌的作用很早就被公認[10]。一篇最近的文獻報道，PDE5在心肌病病人左室表達增加，并且在心梗后導(dǎo)致心室重構(gòu)[11]。

細胞凋亡是由遺傳基因決定的程序性細胞死亡，可以被一些刺激激活，例如生長因子的減退，凋亡受體信號或者細胞應(yīng)激。我們的免疫熒光檢測分析表明，PDE5 shRNA治療可以明顯降低梗死周邊區(qū)域的心肌細胞凋亡，這些觀察結(jié)果與早先的報道一致-即PDE5抑制劑西地那非可以拮抗心肌局部缺血引起的心肌細胞凋亡[12]，有人提出，cGMP/PKG 通路在PDE5抑制劑抗心肌細胞凋亡方面起到非常重要的作用[13]。我們的實驗觀察到體內(nèi)實驗經(jīng)過PDE5 shRNA治療，PDE5 shRNA對心肌細胞和非心肌細胞在梗死及梗死周邊區(qū)域的抗凋亡作用可以減輕心梗后心室重構(gòu)及心臟功能障礙。

總之，急性心肌梗死后PDE5 shRNA干預(yù)可以通過抑制PDE5表達明顯減輕細胞凋亡，這些發(fā)現(xiàn)或許可以為治療急性心肌梗死后的慢性心功能不全提供新的治療思路。

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