郝雪峰等

摘要：選取有代表性的中性鹽NaCl，設(shè)置0、50、100、150、200 mmol/L 5個(gè)濃度水平，對(duì)山西普遍種植的大豆種子進(jìn)行萌發(fā)脅迫處理，探討大豆種子萌發(fā)期耐鹽性以及耐鹽機(jī)制。結(jié)果表明，低鹽濃度（50 mmol/L）對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，而高鹽濃度抑制萌發(fā)，且隨著NaCl濃度的增高，抑制程度明顯加重；胚根胚芽中SOD和POD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，而Pro和MDA含量則呈逐漸增加的趨勢(shì)。大豆種子在發(fā)芽和生理變化上均表現(xiàn)出一定的耐鹽能力，相比較而言，POD在其萌發(fā)期抵御鹽脅迫時(shí)起重要作用。

關(guān)鍵詞：鹽脅迫； 大豆；種子萌發(fā)；生理變化

中圖分類號(hào)：Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）06-1263-04

土壤鹽堿化已成為世界性問(wèn)題。目前，全球現(xiàn)有耕地中大約有3.4億hm2為鹽堿地[1]，而中國(guó)的鹽堿土比例明顯高于世界平均水平，近1/3的灌區(qū)土壤存在鹽堿化問(wèn)題[2]。鹽堿化已成為制約我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一。

豆科植物在我國(guó)各地均有栽培，其中被譽(yù)為“豆中之王”、“田中之肉”、“綠色牛乳”的大豆因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、糧油兼用等特點(diǎn)而被廣泛栽培。但是，土壤鹽堿化日益加重，已經(jīng)成為影響大豆栽種面積、產(chǎn)量及品質(zhì)的重要因子。對(duì)于大多數(shù)作物而言，種子萌發(fā)和早期幼苗階段對(duì)環(huán)境脅迫最為敏感[3]，因此對(duì)作物的耐鹽性研究大都集中于對(duì)種子發(fā)芽率、萌發(fā)速率以及胚根、胚芽生長(zhǎng)的影響[4-13]，而關(guān)于對(duì)萌發(fā)后胚根和胚芽生長(zhǎng)危害的機(jī)理，以及為了抵御危害在生理上的變化等方面的研究卻很少，尤其是關(guān)于以蛋白質(zhì)為主要貯藏物質(zhì)的大豆種子抗鹽性的研究報(bào)道幾乎沒(méi)有。為此，以大豆種子為試驗(yàn)材料，采用不同濃度NaCl進(jìn)行脅迫處理，通過(guò)統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率等指標(biāo)以及對(duì)相關(guān)溶質(zhì)的測(cè)定，揭示大豆種子萌發(fā)期的耐鹽性生理特性和適應(yīng)機(jī)制，對(duì)于在鹽堿地上種植大豆，力爭(zhēng)全苗、壯苗，提高產(chǎn)量，增加效益以及對(duì)大豆的耐鹽育種都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

優(yōu)質(zhì)大豆種子購(gòu)自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。NaCl購(gòu)自北京市鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)，NaCl設(shè)置0、50、100、150和200 mmol/L 5個(gè)濃度梯度。選擇均一飽滿的種子，置于5層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，加入30 mL處理液，4次重復(fù)，每皿覆蓋5層紗布。紗布提前用對(duì)應(yīng)的處理液浸潤(rùn)，然后置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，每天用稱重補(bǔ)水的方法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，并記錄每日的發(fā)芽數(shù)及發(fā)芽結(jié)束時(shí)的幼芽鮮重。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萌發(fā)指標(biāo)的計(jì)算方法

發(fā)芽勢(shì)=[（3 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）]×100%

發(fā)芽率=[（7 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）]×100%

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt）（Gt為在發(fā)芽時(shí)段內(nèi)每日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間）

活力指數(shù)=GI×S（GI為發(fā)芽指數(shù)，S為發(fā)芽結(jié)束時(shí)的幼芽鮮重）

鹽害指數(shù)=[（對(duì)照組發(fā)芽率-處理組發(fā)芽率）/對(duì)照組發(fā)芽率]×100%

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定方法 發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，取出胚芽和胚根先用自來(lái)水沖洗，然后用去離子水沖洗，表面殘留的水分用濾紙吸干待用。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定參照李合生[14]的氮藍(lán)四唑顯色法，過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定參照張龍翔等[15]的生化試驗(yàn)方法和技術(shù)，游離脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定參照張殿忠等[16]的茚三酮顯色法，丙二醛（MDA）含量的測(cè)定參照李合生[14]的硫代巴比妥酸比色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)大豆種子萌發(fā)的影響

從圖1可以看出，隨著NaCl脅迫濃度的增加，大豆種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在NaCl濃度為0～50 mmol/L時(shí)呈緩慢上升的趨勢(shì)，在鹽濃度為50～200 mmol/L時(shí)呈下降趨勢(shì)。當(dāng)NaCl濃度達(dá)50 mmol/L時(shí)出現(xiàn)最高峰，發(fā)芽勢(shì)比對(duì)照增加了12.13個(gè)百分點(diǎn)，發(fā)芽率比對(duì)照增加了3.7個(gè)百分點(diǎn)，發(fā)芽指數(shù)比對(duì)照增加了1.12%，活力指數(shù)比對(duì)照增加了6.05%；當(dāng)NaCl濃度達(dá)200 mmol/L時(shí)，發(fā)芽勢(shì)降低為39.17%，發(fā)芽率降低為60.00%，發(fā)芽指數(shù)降低為18.55，活力指數(shù)降低為119.46。與此相反，鹽害指數(shù)隨著NaCl脅迫濃度的增加呈先降低后增高的趨勢(shì)，其中50 mmol/L時(shí)鹽害指數(shù)為-3.70%，之后隨著鹽濃度的增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度達(dá)200 mmol/L時(shí)，鹽害指數(shù)為33.33%。綜合比較得知，在整個(gè)脅迫范圍內(nèi)活力指數(shù)的變化最顯著，尤其是當(dāng)脅迫濃度大于50 mmol/L時(shí)，活力指數(shù)呈驟然降低的趨勢(shì)，其余幾個(gè)指標(biāo)變化幅度不大。

2.2 NaCl脅迫對(duì)大豆種子生理的影響

2.2.1 NaCl脅迫對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 大豆種子萌發(fā)期SOD活性隨NaCl濃度的變化情況見(jiàn)圖2。其活性變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)鹽濃度從0 mmol/L增加到50 mmol/L，酶活性隨之增高；當(dāng)NaCl濃度超過(guò)臨界值（試驗(yàn)臨界值為50 mmol/L）而繼續(xù)增大時(shí)，SOD酶活性隨之下降。

2.2.2 NaCl脅迫對(duì)過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響 如圖3所示，隨著NaCl脅迫濃度的增加，POD酶活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其臨界值出現(xiàn)在NaCl為50 mmol/L時(shí)，此時(shí)POD活性比對(duì)照增加了51.11%，當(dāng)NaCl濃度達(dá)200 mmol/L時(shí)，POD活性比對(duì)照降低了48.74%，總體變化趨勢(shì)同SOD活性，呈現(xiàn)倒“V”形，但較SOD變化劇烈。

2.2.3 NaCl脅迫對(duì)游離脯氨酸（Pro）含量的影響 不同濃度NaCl脅迫下大豆種子中游離脯氨酸的含量見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著NaCl脅迫濃度的增加，游離脯氨酸的含量呈遞增的趨勢(shì)。各脅迫濃度下游離脯氨酸的含量比對(duì)照分別增加了17.72%、41.34%、56.30%和72.05%。

2.2.4 NaCl脅迫對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響 不同濃度NaCl脅迫下大豆種子胚中的丙二醛（MDA）含量見(jiàn)圖5。由圖5可知，丙二醛（MDA）作為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量隨著NaCl脅迫濃度的增加呈逐漸升高的趨勢(shì)，且NaCl濃度為50 mmol/L時(shí)變化幅度較小，MDA含量?jī)H比對(duì)照增加了7.39%，表現(xiàn)出一定的耐鹽性；當(dāng)NaCl濃度為100～200 mmol/L時(shí)MDA含量迅速增加，與對(duì)照相比，100、150、200 mmol/L NaCl脅迫下MDA含量分別增加30.21%、46.14%和69.13%。

3 小結(jié)與討論

3.1 NaCl脅迫對(duì)大豆種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都是衡量種子質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。發(fā)芽率反映種子的發(fā)芽能力，可顯示種子胚的活性，發(fā)芽率高，表示有生活力的種子多，播種后出苗數(shù)多。發(fā)芽勢(shì)測(cè)試種子的發(fā)芽速度和整齊度，發(fā)芽勢(shì)高，表示種子活力強(qiáng)，出苗迅速、整齊、增產(chǎn)潛力大。發(fā)芽指數(shù)是反映種子發(fā)芽活力的指標(biāo)[17]，能反映種子在脅迫環(huán)境下的發(fā)芽能力。活力指數(shù)是種子活力水平的綜合體現(xiàn)，是用來(lái)表示種子萌發(fā)長(zhǎng)成正常幼苗的能力[11]。

低濃度的NaCl能促進(jìn)某些植物種子的萌發(fā)，或?qū)ΨN子萌發(fā)的影響較小，而高濃度的NaCl則有顯著抑制作用。低濃度NaCl脅迫對(duì)獵狗[5]、甜菜[18]、棉花[19]、鹽角草[20]、黃瓜[21]、大豆[22，23]、甘草[24]等種子萌發(fā)均有促進(jìn)作用，這種現(xiàn)象說(shuō)明低鹽可使大豆種子的呼吸作用增強(qiáng)，提高了蛋白酶和脂肪酶的活性，促進(jìn)了貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)大豆的萌發(fā)和生長(zhǎng)，而高濃度鹽脅迫條件下由于鹽所形成的滲透勢(shì)阻礙了種子吸水的速度，且鹽的濃度越高，這種阻礙作用越強(qiáng)，限制了一些水解酶類的迅速合成，影響種子內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分解合成進(jìn)程。

3.2 NaCl脅迫對(duì)大豆種子生理的影響

3.2.1 保護(hù)酶系統(tǒng)的變化 SOD與POD是植物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的主要酶，其主要功能是清除自由基、控制膜脂過(guò)氧化和減輕膜系統(tǒng)的傷害。SOD可以催化O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，從而減緩或消除O2-·對(duì)生物體造成的傷害，是保護(hù)酶機(jī)制中的關(guān)鍵酶；而POD可將H2O2分解為H2O和O2，從而將其濃度控制在安全范圍之內(nèi)，消除H2O2對(duì)細(xì)胞造成的傷害。

為了抵御環(huán)境脅迫介導(dǎo)的活性氧傷害，植物體中保護(hù)酶體系發(fā)生了變化。在NaCl脅迫下大豆耐受的鹽濃度存在一個(gè)閾值（50 mmol/L），在這個(gè)閾值之上，鹽脅迫可能導(dǎo)致大豆胚的極大損傷，而在這個(gè)閾值之下，其受到的損傷可能較輕微，因?yàn)檩p度鹽脅迫誘導(dǎo)大豆胚中保護(hù)酶活性的提高，特別是POD活性顯著升高，表明輕度鹽脅迫下，大豆種子能通過(guò)提高保護(hù)酶活性，以消除脅迫下產(chǎn)生的過(guò)多的氧自由基，從而保持胚中活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡，使其免受傷害，同時(shí)也反映其對(duì)鹽的耐受程度；中度和重度鹽脅迫下酶活性均下降，導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)多的自由基，使得活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡被打破，胚遭到嚴(yán)重的氧化傷害。

3.2.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化 鹽堿生境下種子萌發(fā)的最初階段首先面臨的是由于不同鹽濃度產(chǎn)生的滲透脅迫[25]，而脯氨酸（Pro）積累是植物體抵抗?jié)B透脅迫的有效方式之一。

由于大豆種子中富含蛋白質(zhì)，因此可能為脯氨酸的積累提供了“源頭”，同時(shí)脯氨酸是一種重要的有機(jī)滲透溶質(zhì)，它是水溶性最大的氨基酸，具有較強(qiáng)的水合能力，它一方面使細(xì)胞保持適當(dāng)?shù)臐B透勢(shì)而防止脫水，另一方面對(duì)生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能起穩(wěn)定和保護(hù)作用。

3.2.3 細(xì)胞膜透性的變化 膜透性的大小反映質(zhì)膜受損傷的程度，數(shù)值越大質(zhì)膜受到的傷害也越大[26]。丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，它的表現(xiàn)與膜透性的表現(xiàn)構(gòu)成一對(duì)矛盾的統(tǒng)一體，膜透性是直接反映膜受傷害的程度，MDA間接表示膜受損傷的狀況，并兼有反饋?zhàn)饔谩｛}分能增加細(xì)胞膜透性，加強(qiáng)膜脂過(guò)氧化作用，最終導(dǎo)致膜系統(tǒng)的破壞。有研究認(rèn)為，低鹽濃度下MDA含量反而比對(duì)照低，隨著鹽濃度的增加，MDA含量呈上升趨勢(shì)[12，27]。但在此次研究中，隨著鹽濃度的增加，MDA含量呈上升趨勢(shì)，與李三相等[13]的研究結(jié)論一致。這可能是因?yàn)樵邴}害閾值之下，無(wú)論是保護(hù)酶系統(tǒng)還是滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)都能有效地緩解鹽脅迫對(duì)種胚的傷害，各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)出積極的響應(yīng)狀態(tài)，但當(dāng)脅迫程度進(jìn)一步惡化時(shí)，酶活性下降，活性氧劇增，導(dǎo)致自由基大量形成，這些自由基尤其是羥基自由基加速了膜的損傷和增大了膜脂上不飽和脂肪酸的過(guò)氧化[28]，從而形成大量的MDA。

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