賴曉芳等

摘要：植物溶菌酶是植物防御體系中的一部分，在植物防衛(wèi)體系中具有重要作用。蘿卜中有2個(gè)具溶菌酶活性的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs），分別是CBP1、CBP2組分。為了解CBPs的作用機(jī)制以及在蘿卜中的生理功能，試驗(yàn)研究了CBP1、CBP2溶菌酶組分酶活性的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，CBP1、CBP2在pH 5.4、65 ℃條件下迅速失活，在pH 3.4～10.6、25 ℃條件下較穩(wěn)定；CBP1較CBP2對(duì)氧化劑H2O2、NaClO敏感；CBP2較CBP1對(duì)木瓜蛋白酶敏感；2個(gè)組分對(duì)胰蛋白酶均敏感。

關(guān)鍵詞：蘿卜；溶菌酶活性；幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白；穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)：S631.1；Q556+.2；Q946.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）06-1330-04

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）廣泛存在于生物體內(nèi)，是一類(lèi)專門(mén)作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤，增強(qiáng)免疫力等作用，已在醫(yī)學(xué)、食品、化妝品、生物工程等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。對(duì)于溶菌酶的發(fā)現(xiàn)是從Nicolle 1907年發(fā)表枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）溶解因子的報(bào)告開(kāi)始的[1]；而對(duì)于溶菌酶本質(zhì)的研究則是在1922年Fleming等[2]發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚具有較強(qiáng)的溶菌活性、并把起溶菌作用的因子命名為溶菌酶后開(kāi)始的[3]。在眾多研究中，雞蛋清的溶菌酶（Hen-egg white lysozyme，HEWL）含量多，制備技術(shù)較成熟，所以研究較深入[4]?，F(xiàn)在植物溶菌酶的研究也取得了很大進(jìn)展，研究者們已經(jīng)先后從無(wú)花果（Ficus carica L.）[5]、蕪菁（Brassica rapa L.）[6]、莧菜（Amaranthus mangostanus L.）[7]、花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）等植物的組織中及番木瓜（Carica papaya L.）[8]、大牛角瓜[Calotropis gigantea（L.）W. T. Aiton][9]、三葉橡膠樹(shù)[Hevea brasiliensis（Willd. ex A. Juss.）Muell. Arg.][10]、冠狀狗牙花[Ervatamia coronaria（Jacq.）Stap f.][11]、敘利亞馬利筋（Asclepias syriaca L.）[12]等植物的乳汁中和蘿卜（Raphanus sativus L.）[13]塊根組織中提取到了溶菌酶；蘿卜組織中有2個(gè)具有溶菌酶活性的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs）組分，業(yè)界分別表述為CBP1、CBP2；其對(duì)進(jìn)一步了解植物溶菌酶的作用機(jī)制和拓展植物溶菌酶的應(yīng)用范圍具有一定的研究?jī)r(jià)值。為了弄清楚CBPs的作用機(jī)制以及在蘿卜中的生理功能，試驗(yàn)探討了CBPs溶菌酶活性在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

蘿卜取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院網(wǎng)室栽培的新鮮蘿卜塊根；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）采用美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；木瓜蛋白酶液自行配制，由1份木瓜蛋白酶加9份激活劑組成，激活劑含2 mmol/L乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、20 mmol/L半胱氨酸（Cysteine，Cys）；胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）和胰蛋白酶（10 mg/mL）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；不同pH的磷酸緩沖液自行配制，H2O2、NaClO等為分析純。

1.2 方法

1.2.1 具溶菌酶活性的CBPs分離及純化 參照文獻(xiàn)[13]的方法，將蘿卜塊根洗凈、搗碎、離心、取上清，脫氨、再生、幾丁質(zhì)凝膠親和層析、羧甲基纖維素層析柱離子交換層析，結(jié)果從蘿卜塊根中分離到2個(gè)具溶菌酶活性的酶組分CBP1和CBP2，分別將兩者冷凍干燥，得到粉末狀物質(zhì)，可視為試驗(yàn)所需的酶粉。

1.2.2 CBPs溶菌酶活性測(cè)定 取2個(gè)酶組分的酶粉，在25 ℃環(huán)境下，用pH 5.4、50 mmol/L的磷酸緩沖液溶解，配成2個(gè)酶組分的酶液，待用。參照文獻(xiàn)[13]的方法。用pH 6.2、50 mmol/L 磷酸緩沖液配制溶壁微球菌懸浮液，在30 ℃條件下取2.5 mL上述懸浮液于比色杯中，分別加入0.1 mL的2個(gè)酶組分酶液，迅速攪勻，以每分鐘在450 nm處使吸光度值下降0.001所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 CBPs溶菌酶活性的酸堿穩(wěn)定性 取2個(gè)酶組分的酶粉，用不同pH的50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 2.2～10.6、25 ℃）溶解，放置30 min，分別測(cè)定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個(gè)酶組分之間的酶相對(duì)活性。

1.2.4 CBPs溶菌酶活性的熱穩(wěn)定性 2個(gè)酶組分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸緩沖液溶解，在不同溫度（0～80 ℃）下放置30 min，流水冷卻，分別測(cè)定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個(gè)酶組分之間的酶相對(duì)活性。

1.2.5 CBPs溶菌酶活性在氧化劑H2O2、NaClO中的穩(wěn)定性 2個(gè)酶組分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸緩沖液溶解，分別加入不同終濃度的H2O2（分別配制成5、10、15、20、25 mmol/L梯度溶液）或NaClO（分別配制成5、10、15、20、25、30、35 μg/mL梯度溶液），25 ℃放置30 min，再分別測(cè)定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個(gè)酶組分之間的酶相對(duì)活性。

1.2.6 CBPs溶菌酶活性對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性 分別在1 mL 2個(gè)酶組分酶液中加入1 mL木瓜蛋白酶液，37 ℃水浴10 min后分別測(cè)定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性；分別在1 mL 2個(gè)酶組分酶液中加入胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）或胰蛋白酶（10 mg/mL），經(jīng)30 min后分別測(cè)定CBP1、CBP2組分在一定時(shí)間范圍（60 min）內(nèi)的溶菌酶活性，比較2個(gè)酶組分之間的酶相對(duì)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBPs溶菌酶活性的酸堿穩(wěn)定性

CBPs溶菌酶活性的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，在pH 2.2～pH 3.4時(shí)，CBP2溶菌酶組分的相對(duì)活性升幅小，而CBP1溶菌酶組分的相對(duì)活性升幅大；在pH 3.4～pH 10.6時(shí)，2個(gè)CBPs溶菌酶組分的相對(duì)活性都比較穩(wěn)定；但在pH>10.6時(shí)，2個(gè)CBPs溶菌酶組分的相對(duì)活性迅速降低。

2.2 CBPs溶菌酶活性的熱穩(wěn)定性

CBPs溶菌酶活性的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，在pH 5.4、0～55 ℃范圍內(nèi)，CBPs溶菌酶活性對(duì)溫度不太敏感；60 ℃時(shí)，CBP1溶菌酶組分的酶相對(duì)活性迅速降低，CBP2溶菌酶組分仍殘余75%的酶相對(duì)活性。繼續(xù)升高溫度到65 ℃，則2個(gè)CBPs溶菌酶組分的酶相對(duì)活性都急劇下降至0。

2.3 氧化劑對(duì)CBPs溶菌酶活性的影響

氧化劑對(duì)CBPs溶菌酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3A可見(jiàn)，2個(gè)CBPs溶菌酶組分的酶相對(duì)活性對(duì)NaClO都很敏感，尤其是CBP1溶菌酶組分。從圖3B可見(jiàn)，H2O2對(duì)2個(gè)CBPs溶菌酶組分的酶相對(duì)活性影響呈現(xiàn)明顯的差異：其中CBP1溶菌酶組分的酶相對(duì)活性在H2O2中不穩(wěn)定；CBP2溶菌酶組分的酶相對(duì)活性在低濃度的H2O2中穩(wěn)定，當(dāng)H2O2濃度升高至24 mmol/L時(shí)，則酶相對(duì)活性迅速下降至41%。

2.4 蛋白酶對(duì)CBPs溶菌酶活性的影響

蛋白酶對(duì)CBPs溶菌酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4A可見(jiàn)，木瓜蛋白酶對(duì)2個(gè)CBPs溶菌酶組分的酶相對(duì)活性的影響差異明顯；隨著作用時(shí)間的增加，CBP1溶菌酶組分的酶相對(duì)活性出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，CBP2溶菌酶組分的酶相對(duì)活性變化趨勢(shì)為迅速下降至8.7%。胰凝乳蛋白酶對(duì)CBPs溶菌酶活性無(wú)明顯的作用（所以結(jié)果未顯示）。從圖4B可見(jiàn)，胰蛋白酶對(duì)CBPs溶菌酶組分的酶相對(duì)活性的影響結(jié)果是隨著作用時(shí)間的增加表現(xiàn)明顯，如作用60 min后CBP1和CBP2溶菌酶組分的酶相對(duì)活性均下降至20%左右。

3 討論

溶菌酶是一種堿性蛋白質(zhì)，大部分溶菌酶在酸性條件下比較穩(wěn)定，對(duì)熱不穩(wěn)定，如大麥溶菌酶在pH 4.0、60 ℃以上的環(huán)境里急速失活；雞蛋清溶菌酶在pH 3.0時(shí)能耐受100 ℃高溫達(dá)45 min之久[14，15]。試驗(yàn)進(jìn)行的蘿卜CBPs溶菌酶活性的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性研究得到了類(lèi)似的結(jié)果，都是在pH 5.4、65 ℃時(shí)迅速失活，而常溫下在pH 3.4～10.6范圍都較穩(wěn)定。

Meyer[16]研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下用N-溴代琥珀酰亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）、氯化碘（ICl）均可氧化雞蛋清溶菌酶的色氨酸（Tryptophan，Trp），CBPs溶菌酶活性對(duì)NaClO（0.003%）也很敏感，專一性化學(xué)修飾劑NBS證明Trp是CBP2溶菌酶組分活性中心的必需氨基酸殘基，故有可能是氧化劑NaClO與Trp形成了復(fù)合物的緣故。李培峰等[17]在研究H2O2對(duì)Cu·Zn-超氧化物歧化酶活力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：隨著H2O2濃度的升高及作用時(shí)間的增加，Cu·Zn-超氧化物歧化酶的活力下降；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，還會(huì)使組氨酸（Histidine，His）含量減少，天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、谷氨酸（Glutamic acid，Glu）增加。而蘿卜CBPs對(duì)H2O2較敏感，使用專一性化學(xué)修飾劑證明Asp/Glu和His可能是溶菌酶活性中心的氨基酸殘基，增加Asp、Glu可能會(huì)改變活性中心的構(gòu)象，或者能減少His對(duì)活性的破壞作用[18]。

木瓜蛋白酶是一種多酶混合物，其中的各種酶之間相互協(xié)同，故水解蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)。對(duì)于CBP1溶菌酶組分而言，可能由于剛加酶液時(shí)，活性中心處于木瓜蛋白酶分子達(dá)不到的溶菌酶組分分子的內(nèi)部，此時(shí)木瓜蛋白酶并不降解活性中心，反而通過(guò)降解其他部位的賴氨酸（Lysine，Lys）、精氨酸（Arginine，Arg）的C-末端，使得分布在各肽段活性中心的構(gòu)象變成更加適合底物溶壁微球菌的結(jié)合降解。隨著時(shí)間的推移及構(gòu)象的變化，會(huì)使活性中心暴露，木瓜蛋白酶將活性中心的Glu、Asp降解，破壞了活性中心，故酶活力減弱；而對(duì)于CBP2溶菌酶組分來(lái)說(shuō)，可能由于酶活性中心處于易被蛋白酶水解的位置，故加入木瓜蛋白酶后其活性中心馬上被降解，酶活性迅速降低，其對(duì)木瓜蛋白酶的敏感程度遠(yuǎn)大于CBP1。胰蛋白酶對(duì)CBPs溶菌酶活性的影響是隨著作用時(shí)間的增加體現(xiàn)出來(lái)的，CBP1和CBP2溶菌酶組分的活性對(duì)胰蛋白酶均為敏感。

綜上所述，蘿卜CBPs的穩(wěn)定性存在差異：CBP2溶菌酶組分對(duì)酸及在pH 5.4時(shí)對(duì)熱較CBP1穩(wěn)定，對(duì)木瓜蛋白酶較CBP1溶菌酶組分敏感；CBP1對(duì)氧化劑H2O2、NaClO較CBP2敏感。這種穩(wěn)定性的差異可能與CBPs氨基酸序列及溶菌酶活性中心的構(gòu)象差異有關(guān)。

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