范三微等

摘要：以靈菊七（Gynura medica）無(wú)菌試管苗葉片為外植體，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織，并進(jìn)行愈傷組織繼代培養(yǎng)。將繼代培養(yǎng)的愈傷組織接種于含有不同激素（濃度）組合的愈傷增殖培養(yǎng)基上，以硝酸鋁顯色法測(cè)定其中黃酮的含量。結(jié)果表明，在4種愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，愈傷組織中總黃酮含量最大值分別達(dá)到0.794%、2.112%、1.652%、2.792%。培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L GA最適用于靈菊七愈傷組織中黃酮總量的積累。

關(guān)鍵詞：靈菊七（Gynura medica）；愈傷組織；植物激素；黃酮

中圖分類(lèi)號(hào)：S567；Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）06-1450-03

藥用植物靈菊七（Gynura medica）俗名仙草、長(zhǎng)壽草，其在中國(guó)福建地區(qū)具有豐富資源，在浙江、江蘇、安徽等省區(qū)也有種植，民間采其植株莖、葉泡茶飲用來(lái)防治糖尿病已有較長(zhǎng)的歷史。黃酮類(lèi)化合物廣泛存在植物體內(nèi)，具有多種生理功能，是多種中藥發(fā)揮生理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)靈菊七的提取物生物活性研究證明靈菊七含有的黃酮類(lèi)、酚類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化活性[4]；靈菊七的水、醇提物對(duì)糖尿病大鼠有顯著治療作用[5，6]，這些研究顯示出靈菊七具有廣闊的降血糖藥用開(kāi)發(fā)前景。

該研究以靈菊七葉片為外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中激素種類(lèi)與濃度，促進(jìn)愈傷組織合成黃酮類(lèi)物質(zhì)，為生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)靈菊七黃酮提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

靈菊七植株采自安徽省六安市，經(jīng)安徽師范大學(xué)周守標(biāo)教授鑒定為Gynura medica Y. K. Yang et J.K.Wu，以此為母本開(kāi)展組織培養(yǎng)研究，并獲得了大量的靈菊七試管苗，以此試管苗作為試驗(yàn)材料[7]。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器購(gòu)自日本Sanyo Industry公司；BCM-1000型生物凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX智能型生化培養(yǎng)箱及PQX型多段智能人工氣候箱購(gòu)自寧波江南儀器廠；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海申勝生物技術(shù)有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自常州國(guó)華電器有限公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限公司。

鹽酸、亞硝酸鈉、乙醇、硝酸鋁等試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；玉米素（ZT）、α-萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、激動(dòng)素（KT）、赤霉素（GA）等植物激素及瓊脂均為國(guó)產(chǎn)生物試劑。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 以MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至6.0，常規(guī)滅菌。取無(wú)菌試管苗葉片，切成面積約1 cm2的小塊，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10塊。置于人工氣候箱中（光照周期12 h，26 ℃，2 000 lx）進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后每天觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3.2 愈傷組織中黃酮的增殖培養(yǎng) 將愈傷組織進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)，每次繼代培養(yǎng)周期為12 d。按2.0 g/瓶，把愈傷組織分別接種于不同激素組合的固體增殖培養(yǎng)基（表1）上（40 mL/100 mL三角瓶），通過(guò)檢測(cè)愈傷組織中黃酮含量考察不同激素對(duì)愈傷組織中黃酮生物合成的影響。置于人工氣候箱中（培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)培養(yǎng)），接種后每2 d取樣一次，測(cè)定細(xì)胞增長(zhǎng)量、總黃酮含量（均以干重計(jì)）。

1.3.3 蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立 精確配制0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，6個(gè)10 mL容量瓶中分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇5 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，然后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，再用蒸餾水定容，搖勻后放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 愈傷組織中總黃酮的提取及含量測(cè)定 稱取適量愈傷組織，按料液比1∶30加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，50 ℃水浴回流2 h，過(guò)濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，再用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液準(zhǔn)確定容。按“1.3.3”中方法檢測(cè)愈傷組織中總黃酮的含量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈菊七愈傷組織的誘導(dǎo)

取靈菊七無(wú)菌試管苗葉片（圖1），接種在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。ZT顯示出了強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，在葉片組織塊接種后第9天，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到84.4%，第14天時(shí)達(dá)到100.0%，愈傷組織呈白色疏松狀（圖2）。

2.2 蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的方法測(cè)定愈傷組織中總黃酮含量。以10 mL溶液中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8，9]。計(jì)算蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得：y=6.686 29x+0.004 17，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，說(shuō)明在0～0.5 mg/10 mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 不同植物激素對(duì)靈菊七愈傷組織中黃酮生物合成的影響結(jié)果

表1中設(shè)計(jì)了4種影響愈傷組織中黃酮生物合成的增殖培養(yǎng)基，其中1號(hào)與2號(hào)培養(yǎng)基的激素種類(lèi)一致，但6-BA的濃度不一致；3號(hào)與4號(hào)培養(yǎng)基的激素種類(lèi)不同，但各種激素的濃度一致。

按“1.3.2”中的方法計(jì)算細(xì)胞增長(zhǎng)量。愈傷組織在不同激素組合的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，愈傷組織快速生長(zhǎng)期集中在接種后的10～26 d，隨后愈傷組織生長(zhǎng)進(jìn)入停滯期。比較愈傷組織在各培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量，4組之間愈傷組織生長(zhǎng)量雖有差異，但未達(dá)顯著性水平（P>0.05）。

在不同激素增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，靈菊七愈傷組織中總黃酮含量的變化情況見(jiàn)圖4。由圖4可知，靈菊七愈傷組織中黃酮大量積累的時(shí)間出現(xiàn)在接種后的18～36 d，第36天后愈傷組織中總黃酮的積累進(jìn)入停滯期；黃酮積累量從高到低的培養(yǎng)基編號(hào)是4、2、3、1。

愈傷組織經(jīng)過(guò)40 d的繼代培養(yǎng)，呈現(xiàn)出不同深淺的顏色，結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，1號(hào)培養(yǎng)基上的愈傷組織主要呈白色，褐化不明顯（A）；2號(hào)培養(yǎng)基上的愈傷組織呈淺綠色，無(wú)褐化（B）；3號(hào)培養(yǎng)基上的愈傷組織主要呈黃綠色，褐化比較明顯（C）；4號(hào)培養(yǎng)基上的愈傷組織為較深的綠色，少部分褐化（D）。

雖然愈傷組織的生長(zhǎng)量各培養(yǎng)基間無(wú)顯著性差異，但其中黃酮的含量則有差異，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，呈白色的愈傷組織黃酮含量為0.794%，而呈綠色的愈傷組織中黃酮含量達(dá)2.792%，1號(hào)培養(yǎng)基的愈傷組織黃酮含量極顯著低于2、3、4號(hào)培養(yǎng)基上的愈傷組織（P<0.01），3號(hào)培養(yǎng)基的愈傷組織黃酮含量也低于2、4號(hào)培養(yǎng)基的。

3 小結(jié)與討論

本研究以靈菊七葉片為外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織，并接種于4種不同的增殖培養(yǎng)基上，以獲得黃酮為目的進(jìn)行培養(yǎng)。本課題組對(duì)靈菊七愈傷懸浮培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)細(xì)胞內(nèi)有大量糖類(lèi)物質(zhì)的積累[10]，而黃酮含量非常低。細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)愈傷組織中黃酮的積累也處于較低的水平，而細(xì)胞干重持續(xù)增加，可能是由于細(xì)胞糖類(lèi)、蛋白類(lèi)物質(zhì)積累產(chǎn)生的結(jié)果。靈菊七愈傷組織中黃酮大量合成是在細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以后，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)處于停滯期時(shí)愈傷組織中黃酮的生物合成非常旺盛，并達(dá)到最大積累量。黃酮是植物的次生代謝產(chǎn)物之一，其生物合成的起始底物為香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A[11]。植物細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A來(lái)源于糖類(lèi)代謝，因此愈傷組織中干物質(zhì)的積累有利于黃酮的生物合成。

本研究中愈傷組織增殖培養(yǎng)前所有的愈傷組織均培養(yǎng)在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上，因此接種于不同增殖培養(yǎng)基上的愈傷組織中黃酮含量無(wú)差異，而經(jīng)過(guò)40 d的繼代培養(yǎng)，愈傷組織中黃酮類(lèi)的積累量之間呈現(xiàn)出差異（表2）。1、2號(hào)培養(yǎng)基中激素種類(lèi)相同，組激素濃度不同。當(dāng)6-BA∶NAA=1時(shí)，愈傷組織中黃酮最大積累量為0.794%；當(dāng)6-BA∶NAA=4時(shí)，愈傷組織中黃酮最大積累量（2.112%），表明6-BA濃度高于NAA濃度時(shí)有利于愈傷組織中黃酮類(lèi)的生物合成。3、4號(hào)培養(yǎng)基中激素種類(lèi)不同，各激素濃度相同，3號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織中黃酮最大積累明顯低于4號(hào)培養(yǎng)基上的愈傷組織，表明GA促進(jìn)黃酮生物合成的作用比KT強(qiáng)。綜上分析表明，靈菊七細(xì)胞內(nèi)黃酮生物合成受激素濃度和激素種類(lèi)的影響。有研究報(bào)道菊三七屬植物紅鳳菜（Gynura bicolor）花色素的生物合成受茉莉酮酸酯誘導(dǎo)而在根中合成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)處理紅鳳菜的組培苗根，茉莉酮酸酯誘導(dǎo)了調(diào)控類(lèi)黃酮生物合成基因GbMYB1、GbMYC1的協(xié)同表達(dá)，造成花色素在根中的積累[12，13]?；ㄉ睾忘S酮都是類(lèi)黃酮化物之一，生物合成花色素的前體也是黃酮生物合成的前體。靈菊七與紅鳳菜都是菊三七屬植物，并且都能合成紫色的色素，因此推測(cè)與黃酮類(lèi)生物合成有相似的機(jī)理。究竟是何種激素對(duì)靈菊七黃酮生物合成發(fā)揮調(diào)控作用，有待于進(jìn)一步的研究。

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