吳桂蘭 李秀明 何曉蕾 李丹丹 邱立明

摘要：本文對(duì)青霉素酶對(duì)青霉素殘留生乳檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行了簡要分析。

關(guān)鍵詞：青霉素酶“解抗劑”生乳檢測(cè)

0 引言

乳制品在人們?nèi)粘Ｉ钪姓紦?jù)著日益重要位置的同時(shí)其安全問題也越來越引起人們的重視[1]。在眾多不安全因素中，抗生素殘留由于會(huì)造成耐藥菌傳播，對(duì)飲用者身體健康造成不利的影響，已經(jīng)引起各方關(guān)注[2]。目前市場(chǎng)上無抗和有抗奶的收購價(jià)差異較大，為了掩蓋生乳中的抗生素殘留，“解抗劑”也相應(yīng)有了廣泛的市場(chǎng)。所謂“解抗劑”，主要是指β-內(nèi)酰胺酶類可以選擇性分解β-內(nèi)酰胺類抗生素的一種蛋白。它可以在短時(shí)間內(nèi)分解牛乳中的抗生素殘留，使抗生素殘留奶通過檢測(cè)[3]。在實(shí)際生產(chǎn)中，很多乳品生產(chǎn)廠家利用抗生素殘留檢測(cè)和乳酸菌類在有抗生素殘留的牛乳中不發(fā)酵或異常發(fā)酵的情況判定生乳是否含有抗生素[1]。那采用“解抗劑”處理過的抗生素殘留奶能否通過相應(yīng)檢測(cè)呢？本次試驗(yàn)旨在探討β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素殘留生乳檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 ①菌株。藤黃微球菌( Micrococcus Luteus )CMCC(B)28001購自國家醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心。乳酸菌YO-MIX 495 LYO100DCU購自丹尼斯克公司（中國代理）。②試劑與培養(yǎng)基。青霉素鈉（4000000U/支），山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（4000000U/mL），中國藥品生物制品檢定所；抗生素快速檢測(cè)試紙條，twin-sensor。③生乳。無抗生素生乳采自山東銀香偉業(yè)集團(tuán)有限公司自控養(yǎng)殖小區(qū)。

1.2 方法 ①青霉素溶液配制。用10ml生理鹽水完全稀釋1支400萬單位的青霉素鈉，即得到400000U/ml的青霉素溶液。②抗生素殘留的檢測(cè)。取10支試管進(jìn)行標(biāo)記，分別加入20ml無抗生素生乳，煮沸5min冷卻后在2-10支試管中分別加入1ml青霉素溶液。再向3-10號(hào)試管中依次加入不同含量的β-內(nèi)酰胺酶，立即進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè)。于37℃溫育30min再次進(jìn)行檢測(cè)。抗生素殘留檢測(cè)按照twin-sensor試劑盒說明書進(jìn)行。③杯碟法進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)[4]。按照下列順序分別將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1mg/mL）、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（16000U/mL）、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）加入到樣品和純水中：(A)青霉素5μL；(B)舒巴坦25μL、青霉素5μL；(C)β-內(nèi)酰胺酶25μL、

青霉素G5μL；(D)β-內(nèi)酰胺酶25μL、舒巴坦25μL、青霉素5μL。并將上述A～D試樣各200μL加入放置于培養(yǎng)基上的4個(gè)牛津杯中，37℃培養(yǎng)20h后測(cè)量抑菌圈直徑并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。④生乳發(fā)酵。在上述10支試管中分別加入0.6ml乳酸菌，混勻后于42℃水浴發(fā)酵。

2 結(jié)果

2.1 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素的分解作用 10支生乳加入β-內(nèi)酰胺酶后立即進(jìn)行抗生素檢測(cè)，結(jié)果如圖1.A所示：1為陰性，2為陽性，3-5為陽性，6為弱陽性，7-10為陰性，此現(xiàn)象說明含量高于等于150萬單位的β-內(nèi)酰胺酶在常溫下可以迅速降解40萬單位的青霉素。溫育30min后，再次對(duì)10支試管中的牛奶進(jìn)行抗生素檢測(cè)，結(jié)果如圖1.B所示：1為陰性，2為陽性，3-4為陽性，5為弱陽性，6-10為陰性，此現(xiàn)象說明β-內(nèi)酰胺酶在適宜的溫度條件下水解能力會(huì)增強(qiáng)，含量高于等于80萬單位的酶在37℃下作用30min可以降解40萬單位的青霉素。

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2.2 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素牛奶發(fā)酵結(jié)果的影響 對(duì)10支試管中的乳品進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵2.5h，5h，7.5h，10h，24h各對(duì)其進(jìn)行一次觀測(cè)，發(fā)酵結(jié)果如表1所示。由圖2可以看出：發(fā)酵2.5h時(shí)1已完全發(fā)酵，2-8未發(fā)酵，9-10 未完全發(fā)酵（圖2，B）；發(fā)酵5h時(shí)1發(fā)酵，2、3未發(fā)酵，4未完全發(fā)酵，5-10 完全發(fā)酵（圖2，C）；7.5h時(shí)，1發(fā)酵，2未發(fā)酵，3未完全發(fā)酵，4-10 完全發(fā)酵（圖2，D）；10h和24h時(shí)，除陽性對(duì)照2未發(fā)酵，其他樣品均已完全發(fā)酵（圖2，E，F(xiàn)）。

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2.3 β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè) 采用杯碟法對(duì)無抗生素生乳1號(hào)樣品與經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶分解過的抗生素生乳5號(hào)樣品進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，同時(shí)用純水作為對(duì)照，其檢測(cè)結(jié)果如圖3所示：

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經(jīng)過對(duì)抑菌圈的測(cè)量，可以看出5號(hào)樣品中(B)和(D)均產(chǎn)生抑菌圈，且(C)與(D)抑菌圈差異在3mm以上(含3mm)時(shí)，(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差異在3mm以上(含3mm)即5號(hào)檢出β-內(nèi)酰胺酶；1號(hào)樣品中(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差異小于3mm，說明未添加有β-內(nèi)酰胺酶，結(jié)果與前期試驗(yàn)吻合。

3 討論

3.1 牛奶抗生素快速檢測(cè)和發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果顯示 在添加抗生素的牛奶中加入β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行分解后，添加過抗生素的生乳可以通過抗生素快速檢測(cè)并完成發(fā)酵試驗(yàn)。這說明β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素殘留奶的掩蔽作用比較明顯，只通過抗生素檢測(cè)和發(fā)酵試驗(yàn)并不能真正意義上杜絕抗生素殘留奶，因此乳品企業(yè)在實(shí)際工作中不能只采用抗生素快速檢測(cè)和牛奶發(fā)酵試驗(yàn)的方法對(duì)牛奶中是否添加抗生素進(jìn)行判定，還需要輔以其他檢測(cè)手段，尤其要加強(qiáng)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶等解抗劑的檢測(cè)[5]。

3.2 畜牧業(yè)在近年來迅速發(fā)展，牛奶作為營養(yǎng)最全面、消化率最高、鈣含量豐富的食品之一，受到消費(fèi)者的歡迎[6]，同時(shí)其質(zhì)量及其安全性也倍受關(guān)注。牛奶中殘留抗生素會(huì)危害飲用者身體健康，而非法添加解抗劑掩蔽牛奶中的抗生素可能助長牛奶生產(chǎn)中β-內(nèi)酰胺類抗生素的濫用，這會(huì)加速耐藥菌的傳播[7]，與人體直接濫用抗生素的危害類似，甚至更加嚴(yán)重。因此，我們不但要關(guān)注牛奶中的抗生素殘留，更要加強(qiáng)對(duì)“解抗劑”的關(guān)注，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，帶給消費(fèi)者真正健康、安全的乳品。

參考文獻(xiàn)：

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